基質硬度與肝癌細胞增殖及侵襲轉移的關系

樊文哲，孫雪梅，吳德全

（哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 普通外科，黑龍江 哈爾濱 150086）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是一種常見惡性腫瘤，因為肝癌細胞增殖能力強、侵襲轉移發生早，多數患者確診時已屬于晚期并發生遠處轉移，即使能夠手術者，其術后復發率也較高。所以，肝癌已成為僅次于肺癌的全球癌癥相關死亡第二大原因[1]。腫瘤細胞侵襲轉移是一個既涉及腫瘤細胞從原發灶向周邊擴散，又涉及腫瘤細胞穿過血管內皮和趨化性通過鄰近胞外基質的多環節多步驟的復雜過程。基質硬度是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的重要物理屬性，大量基質蛋白沉積和交聯可導致基質硬度增加。越來越多的研究表明，胞外固態基質不僅在腫瘤生長中起到結構支撐作用，更可作為腫瘤微環境的重要組成成分，參與癌細胞侵襲轉移過程的調控。因此，基質硬度等物理信號的變化，對腫瘤細胞增殖和侵襲轉移調控的研究逐漸受到重視。本文將分別從基質硬度如何通過參與細胞遷移運動、血管生成與血管表型、上皮間充質轉化、干細胞性及糖代謝等途徑影響肝癌細胞增殖及侵襲轉移進行綜述。

1 基質硬度與細胞遷移運動

細胞遷移是腫瘤細胞離開原發病灶向臨近組織侵襲的起始步驟，腫瘤細胞在轉移過程中有多種遷移方式，如間充質樣遷移或阿米巴樣遷移，但無論哪種遷移方式都依賴于腫瘤細胞和ECM之間的特殊理化作用。不同硬度基質上培養的細胞，形態特征和運動能力明顯不同。細胞外基質硬度的改變可以破壞細胞間連接、影響水解酶的活性和黏附斑的形成，并改變整合素和細胞外基質成分之間的相互作用。普遍的觀點認為硬度高的基質促進細胞遷移，即細胞遷移有趨硬性，這在多種類型的細胞中如成纖維細胞、白細胞、腫瘤細胞等均有證實[2-3]。所以，細胞外基質的硬度是影響細胞遷移的一個重要因素。

間充質樣遷移需要激活整合素以利于黏附，并招募蛋白水解酶聚集，蛋白水解酶與ECM相互作用，促使基質纖維降解和重組，從而降低基質對細胞的阻力以利于細胞移動。阿米巴樣遷移是一種非蛋白酶依賴的遷移方式，通過收縮擠壓自身變形來促使細胞穿過胞外基質間隙。譚喬燕等[4]發現硬基質可通過促進應力纖維的發育、促進基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的分泌和整合素的表達等來促進細胞間充質樣遷移。而軟基質則可以通過增強細胞的柔韌性、形成環狀排列的骨架纖維、減少MMPs的分泌和整合素的表達來誘導細胞阿米巴樣的遷移。腫瘤細胞侵襲過程中，可以根據基質硬度的不同而隨時變換遷移方式，以適應周圍環境的變化，從而大大增強了腫瘤細胞的遷移能力。

侵襲性偽足的形成是維持腫瘤細胞高遷移和高侵襲能力的關鍵，也是促進腫瘤侵襲轉移進程的重要分子事件之一。有報道顯示，基質硬度的改變可影響腫瘤細胞侵襲性偽足形成及活性。Chakraborty等[5]發現，與正常肝細胞相比，肝癌細胞可過表達和分泌蛋白多糖Agrin，促進Arp2/3復合物依賴性侵襲性偽足形成。進一步研究顯示，基質硬度增加促進Agrin表達，Agrin經整合素Lrp4/MuSK受體通路激活轉錄因子YAP，從而增強肝癌惡性表型[6]。由此可見，基質硬度可能通過影響Agrin-YAP途徑調控肝癌細胞侵襲性偽足形成。另外，侵襲性偽足中信號蛋白Cas和FAK的磷酸化活躍，過表達Cas或FAK可增加硬基質表面生長的細胞侵襲性偽足的活性，說明基質硬度也可通過Cas/FAK信號通路調控侵襲性偽足的活性，進而促進細胞遷移。

2 基質硬度與血管生成及血管表型

血管生成是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發育形成新血管的過程。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是影響血管生成的關鍵因素之一。VEGF與血管內皮細胞受體結合后，受體發生自身磷酸化，觸發酪氨酸激酶的系列信號級聯反應，從而發揮生物學效應，誘導血管內皮細胞增殖和遷移，并最終分化為成熟血管。一般說來，腫瘤血管比正常組織的血管更畸形、更曲折、更易滲漏。腫瘤血管異常被認為是由于VEGF表達上調導致血管生長混亂和未能建立成熟的調節網絡所致。Dong等[7]發現胞外基質硬度增加通過激活整合素β1-PI3K-AKT信號途徑上調肝癌細胞VEGF表達，進而促進血管新生。ECM硬度也影響VEGF受體（VEGFR）的表達和血管發育。GATA2和VEGFR2 的表達隨著底物硬度的增加而增加，其中GATA2 調節VEGFR2的表達[8]。VEGFR2 經過快速誘導和核移位，進行無需配體參與的磷酸化，引發MAPK、PI3K和AKT信號通路的激活，促進血管生成[9]。增加基質硬度還可以增強細胞與腫瘤微環境中可溶性因子間的反應，在某些情況下，基質硬度增加可以改變可溶性因子觸發的信號通路[10]。基質硬度和可溶性因子之間的相互作用可能促進血管生成并誘導甚至惡化腫瘤樣血管表型。

在血管生物學中，內皮細胞毛細血管樣網絡的形成受基質硬度的影響[11]。在血管生成過程中，MMP活化對ECM降解和基底膜重塑起重要作用，上調MMPs的活性，特別是膜型1 MMP（MT1-MMP）能夠增加血管表型的改變和血管生成反應[12]。已有研究證實MT1-MMP的激活依賴于細胞的收縮和基質硬化[13]。另外，基質硬度增加可促進肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化，活化后的HSCs也可產生大量的血管生成因子，如VEGF和血管生成素1（Angpt1）或Angpt2，激活內皮細胞的受體并增強其功能，從而促進腫瘤血管生長[10，14]。

3 基質硬度與上皮間質轉化（EMT）

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一種細胞分化過程，極化的上皮細胞歷經變化之后，失去細胞極性和細胞間黏附，獲得遷移能力、侵襲性和對凋亡的抵抗力，從而呈現間充質表型。持續惡化的EMT可能會導致各種病理情況的發生，如轉移和組織纖維化。

EMT常發生于腫瘤侵襲轉移的起始過程中，可溶性因子、ECM成分和缺氧可誘導腫瘤細胞從上皮狀態向間質狀態轉化[15]。除此之外，基質硬化與可溶性因子協同作用也可以促進腫瘤細胞間充質轉化，進而推動轉移的進展。已有研究表明[10]，轉化生長因子-β（transforming growth factors-β，TGF-β）誘導的EMT依賴于基質的機械特性，TGF-β可以在硬度較高的基質表面誘導EMT，但在硬度較低的基質表面則會誘導細胞凋亡。TGF-β1，被認為是上皮細胞（包括肝細胞）中主要的EMT啟動子。胞外基質硬度增加可通過激活Smad2/3獨立誘導肝癌細胞EMT發生，TGF-β1刺激使癌細胞EMT更為完全[7]。

NADPH氧化酶（NOX）是一種位于細胞膜上的酶，能產生與EMT相關的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[16]。研究顯示，較高的基質硬度加強了偽足蛋白S100A11與NOX亞基p67phox和p47phox的相互作用，并促進了NOX的聚集。S100A11上調促進了ROS的產生和Snail的表達，這有助于EMT在HCC細胞中發生[17]。另一個偽足蛋白eIF4E也參與肝細胞癌基質硬度誘導的EMT，eIF4E在多種人類惡性腫瘤中高表達，并與癌癥的發生和發展有關[18]。在較高硬度的基質刺激下，HCC細胞中Raf1和eIF4E的磷酸化水平以及Snail的表達顯著增加。Raf1-elF4E通路調節Snail和MMP-3的表達，進而調控EMT發生[19]。另外，miRNAs的抑制或增強總是發生在EMT增加的腫瘤侵襲和轉移中[20]。較高的基質硬度通過減少miRNA24-3p的表達，促進了TGF-β1的自分泌，并與Snail的高表達和肝癌細胞內EMT的發生有關[17]。

4 基質硬度與干細胞特性

癌細胞的干細胞特性主要表現為干性標志物表達、干性相關轉錄因子表達、化療耐藥及自我更新能力增強等，與癌細胞侵襲性增加和腫瘤患者臨床預后不良有關。Schrader等[21]將Huh7 和HepG2細胞株培養在基質硬度為1 KPa和12 KPa的培養基上發現，與低硬度基質相比，生長于高硬度基質表面的肝癌細胞干性標志物的表達明顯減少，但其對順鉑更耐受，說明高硬度基質可減弱肝癌細胞的干細胞性并增加其耐藥性。而另外一項研究得出的結論有所不同，You等[22]將HuH7和Hep3B細胞株分別培養在底物硬度為6 KPa、10 KPa、16 KPa的培養基上，結果表明，不但肝癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性隨著基質硬度的增加而增加，并且CD133（+）/EpCAM（+）細胞比例、干性相關轉錄因子表達、自我更新能力也隨著基質硬度的增加而增加。因此其認為，較高的基質硬度可誘導和增強肝癌細胞的化療耐藥性和干性特征。但Tian等[23]將MHCC97H細胞株分別培養在5.9 KPa、24.8 KPa及48.1 KPa的培養基上發現，細胞在軟基質上呈現小而圓表型、干性標志物表達增加、細胞成球能力增強，表明生長在軟基質上的肝癌細胞增強了干細胞特性。另外，生長在軟基質上的肝癌細胞表現出對5-氟尿嘧啶更強的耐受性。顯然，這一結果與以上的兩個報道又不完全相同。由于目前基質硬度對肝癌干細胞性的研究報道較少，尚無法確認產生差異的具體原因，但我們分析認為出現上述差異的因素可能有以下幾個方面：一是實驗所選細胞株不同，可能每種細胞株對基質硬度的響應能力具有差異性。二是所選化療藥物不同，不同細胞可能對不同化療藥物的敏感性不同。總而言之，雖然現有的研究顯示基質硬度對腫瘤干細胞特性誘導結果不完全一致，但是依然反映了基質硬度對腫瘤干細胞性具有一定的影響，其具體的作用和機制值得進一步深入研究。

5 基質硬度與糖代謝

癌細胞的生長速度異常增快，這需要更高的ATP水平來支持碳水化合物、蛋白質、脂質和核酸的生物合成。Tilghman等[24]研究發現，生長在較硬基質上的細胞表現出較短的細胞周期，細胞代謝活性增強，細胞內ATP水平升高，而腫瘤細胞ATP供應率和細胞增殖率成正比，這一現象提示ECM硬度不僅能夠促進腫瘤細胞增殖，還可能調控其代謝活性。劉秋萍等[25]研究也發現，隨著基質硬度增加，HepG2細胞增殖能力、葡萄糖攝取和Glut1（HepG2葡萄糖轉運蛋白1）表達都顯著增加。由此可見，肝癌細胞所處力學微環境對其增殖有重要影響，較高的基質硬度可能通過調控糖代謝途徑促進肝癌細胞的增殖。

腫瘤ECM硬化和腫瘤細胞代謝重組是腫瘤進展的兩個基本過程[26]。有證據表明，代謝方式變化發生在機械信號轉導通路激活之后[27-28]。有氧糖酵解是包括肝癌細胞在內的大多數癌細胞的代謝標志，其特征是過度消耗葡萄糖和大量產生乳酸。在硬度較高的基質上培養的肝癌細胞葡萄糖消耗和乳酸產生都增加。因為癌細胞一般通過優先表達葡萄糖轉運蛋白（例如Glut1）[29]和關鍵的糖酵解酶（例如HK II和LDHA）[30-31]來加速有氧糖酵解，如在硬度較高基質上培養的肝癌細胞系中觀察到Glut1，HK II和LADH顯著上調。一直以來，癌基因和抑癌基因的突變被認為可導致細胞內多個信號通路的改變，這些信號通路影響腫瘤細胞的新陳代謝，并促進腫瘤生存和生長。并且，許多致瘤信號通路可因基質硬度增加而激活[32]。例如，PI3K/AKT是調控腫瘤的有氧糖酵解的重要途徑，并影響細胞增殖。而ECM的硬度增加會激活PI3K途徑[33]。除了激活mTOR介導的信號外，PI3K通路還調節葡萄糖的吸收和利用。在不依賴胰島素的組織中，PI3K信號可通過AKT調節葡萄糖轉運蛋白Glut1和Glut4的表達，從而刺激磷酸果糖激酶活化并增加葡萄糖攝取[34]，這對增強有氧糖酵解至關重要。因此，PI3K調節PIP3以及隨后激活AKT和mTOR，代表了基質硬度和ECM沉積的增加影響細胞新陳代謝。Liu等[35]發現，基質硬度作為MAPK信號軸的上游，激活MAPK的磷酸化，進而觸發YAP的活化，從而調節糖酵解。Hu等[36]研究發現，基質硬度也可能通過影響p53基因來調節新陳代謝，因為AKT通過MDM2驅動p53基因的降解。

6 小結與展望

隨著不同基質硬度體外平臺的建立，生物力學得到了明顯的發展，基質硬度對肝癌的影響越來越受到重視。但是，有些研究的結果出現明顯差異，甚至是相互矛盾。因此，需要建立并完善更加符合生理環境的三維培養平臺，制定更加優化和標準化的實驗方法來研究基質硬度對肝癌細胞增殖及侵襲和轉移的影響。隨著研究的進一步深入，未來基質硬度可能有望成為判斷肝癌預后的指標甚至成為有效的治療靶點。