單糖組合對藤壺金星幼蟲附著的影響研究

尤嘉杰 ，平雙雙 ，劉琪 ，靳翠麗 ，2，周曉見 ，2

（1.揚州大學環境科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學海洋科學與技術研究所，江蘇 揚州 225127）

海水中的人工設施表面常會發生大量海洋生物聚集生長的現象，被稱為海洋生物污損（Marine Biofouling）[1]。海洋生物污損給海洋資源開發帶來嚴重危害，影響網箱養殖的水體交換和營養競爭，還可能帶來外來生物入侵，危害生態安全。全球每年由于生物污損造成的各類經濟損失超過200 億美元[2-3]。藤壺 Amphibalanus (Balanus) amphitrite 作為無脊椎污損動物的模式生物，和很多養殖經濟無脊椎動物一樣，幼體階段營浮游生活，成體營底棲生活。藤壺浮游階段包括六個無節幼體期和一個金星幼蟲期，金星幼蟲階段不進食，其主要目的是尋找合適的附著點[4]。金星幼蟲有一對觸角，上有嗅覺和觸覺化學感受器，能感知環境中合適的誘導附著信號[5]。幼蟲的附著變態過程需要接受或感知外源信號，然后將外源信號轉換成體內信號傳遞到特定的部位和組織，并啟動附著、組織凋亡和增生，從而完成變態過程，最后固著生長在基質表面[6]。藤壺分布的群居格局就是通過金星幼蟲期的附著變態過程實現的[7]。

藤壺A. amphitrite 產生的糖蛋白復合物（Settlement Inducing Protein Complex, SIPC）可以高效誘導同物種的幼蟲附著，是指引其群居性的化學信號物質之一。SIPC 是一種糖蛋白，已經證明其碳水化合物部分與蛋白質部分在誘導金星幼蟲變態過程中同樣重要。SIPC 亞基中的糖鏈單元對藤壺的幼蟲附著有重要作用[7-8]。另外。海水中物體表面覆蓋著的生物膜由硅藻或細菌分泌的胞外多聚物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）形成基質，其 EPS 也會影響多種底棲無脊椎動物的幼體附著和變態[9-11]。藤壺觸角上的感受器能夠識別 EPS 中的糖鏈特征[5，10，12]。該文前期工作研究的底棲硅藻Stauroneis sp. 的EPS對藤壺金星幼蟲附著也有良好的誘導作用[13]。所以，糖信號可能是指引藤壺金星幼蟲附著的重要因素。

該文研究4 種單糖以及它們的不同濃度對藤壺金星幼蟲附著的影響，通過分析比較，找出誘導活性最強的單糖種類和濃度，為藤壺幼蟲附著的機理研究提供基礎試驗依據。

1 材料和方法

1.1 藤壺幼蟲

藤壺（Amphibalanus amphitrite）成體采自連云港潮間帶（北緯 34°88′，東經 119°19′），獲得無節幼體后，采用Thiyagarajan 等人的方法，在24 ℃下用新鮮人工海水飼養無節幼體，喂飼纖細角毛藻（Chaetoceros gracilis），培養5~6 d 后，得金星幼蟲。生物測試之前，金星幼蟲在4 ℃冰箱存放2 d[14]。

1.2 單糖影響金星幼蟲附著的正交試驗

4 種單糖 D-甘露糖（Man）、D-葡萄糖（Glc）、D-木糖（Xyl）和L-巖藻糖（Fuc）標準品均購自阿拉丁試劑公司。單糖選擇的依據有：這些單糖在前期試驗中對藤壺金星幼蟲附著表現出較好的誘導活性，是藤壺SIPC 的優勢單糖，是藤壺金星幼蟲感受SIPC 的可能識別位點[15]。另外，這些單糖也是該實驗室研究的底棲硅藻Stauroneis sp. EPS 的優勢單糖，該硅藻EPS 對藤壺金星幼蟲附著有良好的誘導作用[13]。

根據前期試驗經驗，單糖 Man、Glc、Xyl 的 3 個濃度分別為 5.00×10-8、1.25×10-8、0.31×10-8mol/L，Fuc 的 3 個濃度分別為 7.60×10-7、1.90×10-7、0.50×10-7mol/L。選擇L9（34）正交表進行四因素三水平的正交試驗，試驗設置見表1，共有9 組試驗，每組試驗重復6 次，培養時間64 h。同時，另設置一組對照，對照組不添加單糖。

1.3 藤壺金星幼蟲附著生物測試

24 孔板的每一個孔中加入1 mL 人工海水（鹽度S=35），再加入20 μL 待測單糖的海水溶液，對照孔僅加20 μL 海水。每個樣品6 個重復，每個孔加入金星幼蟲15 個，24 ℃避光培養。在幼蟲附著培養期間，在 12、20、28 和 64 h 分別記錄每個孔中死亡、浮游和附著金星幼蟲的數量，計算各時間點的附著率[14]。

1.4 數據分析

所有試驗重復6 次，所獲得的數據采用IBM SPSS 22 軟件進行分析，繪圖采用Excel 軟件。

分析正交試驗組別間的差異，選擇單因素ANOVA 方差分析，利用最小顯著差數法（LSD 法）進行多重比較。進行正交試驗直觀分析和方差分析，確定4 種單糖的影響力大小及差異統計學意義，選擇一般線性模型（General Linear Model）/單因變量多因素方差分析（Univariate）/全模型（Full Factorial）分析單糖的主效應，確定有顯著性影響的單糖的最適濃度。與對照組進行比較，分析藤壺金星幼蟲的附著動力學，計算t10、t30、t50和t80（金星幼蟲附著率分別達到10%、30%、50%和80%時的附著時間）[16]，選擇回歸/Probit 計算 t10、t30、t50和 t80。各分析指標差異統計學意義以P=0.050 或0.010 作為標準[17]。

2 結果

2.1 正交試驗不同組別的藤壺金星幼蟲附著情況

在不同單糖種類和濃度組合的9 組正交試驗處理中，藤壺金星幼蟲都能附著，但在不同的附著時間點，各組幼蟲附著率有明顯差異（圖1）。

圖1 正交試驗不同組別藤壺金星幼蟲附著情況

在附著時間為12 h 時，除了第8 和第9 組外，金星幼蟲均有附著，其中第2、3 兩組附著率最高，分別達到45.5%和40.2%，極顯著高于其他各組（P<0.01）。附著時間為20 h 時，附著率最高的仍是第2組，達到68.9%，其次是第1 和第3 組，分別達到45.9%和55.5%，極顯著高于其他各組（P<0.01），其它各組藤壺金星幼蟲也均有附著，附著率最低的是第8 組，只有5.8%。在28h 時，附著率最高的分別是第2、3 組和第1 組，附著率依次達到72.1%、63.9%和54.8%，極顯著高于其他各組（P<0.01），附著率最低組仍然是第8 組，只有8.1%。在附著時間為64 h時，第8 組仍然是附著率最低的，只有42.0%，其次是第4 組，為47.9%，極顯著低于其他各組（P<0.01）。最終，第 1、2、3、6 和第 9 組金星幼蟲附著率均高于70%，最高為第2 組，達到84.0%。第2 組從12 h 到64 h 的附著時間內，附著率始終保持最高，而第8組則始終處于9 組中附著率最低的狀態。因此，4 種單糖形成的9 個組合中，最有利于藤壺金星幼蟲附著的是第 2 組，即 Man（5.00×10-8mol/L）、Glc（1.25×10-8mol/L）、Xyl（1.25×10-8mol/L）和Fuc（1.90×10-7mol/L）的組合誘導金星幼蟲附著的效果最好。

2.2 4 種單糖對藤壺金星幼蟲附著的影響

對正交試驗所得到的試驗結果進行直觀分析，綜合4 個附著時間點的效果來看，4 種單糖對藤壺金星幼蟲附著的影響是不同的，影響力由大到小依次為：Man＞Fuc＞Glc＞Xyl。再對正交試驗的 4 種單糖進行方差分析，以進一步確定4 種單糖對藤壺金星幼蟲的影響是否具有統計學意義，結果見表2。

4 種單糖中，Man 對4 個時間點的藤壺幼蟲附著率均有極顯著影響（P<0.01）。Fuc 在3 個時間點的影響是顯著的，其中在12 h 和20 h 對藤壺幼蟲附著有顯著影響（P<0.05），在64 h 有極顯著影響（P<0.01）。Glc 在2 個時間點對藤壺幼蟲附著的影響是顯著的，在12 h 有顯著性影響（P<0.05），在64 h有極顯著影響（P<0.01）。而Xyl 對4 個時間點藤壺幼蟲附著的影響都不顯著（P>0.05）。因此結合直觀分析和方差分析的結果可以得到的結論是：4 種單糖中Man 對藤壺金星幼蟲附著影響最大且效果是極顯著的，其次影響很大的是Fuc，效果顯著，第三位的單糖是Glc，在一些時間點顯示出顯著的效果，單糖Xyl 對藤壺金星幼蟲的附著沒有顯著性影響。

表2 4 種單糖對藤壺金星幼蟲附著誘導活性的主效應分析（n=6）

附著時間 變異來源 Man Glc Xyl Fuc 誤差 總數SS 21 081.6 1 328.0 131.8 2 757.9 16 448.2 41 747.5自由度 2 2 2 2 45 53 20 h MS 10 540.8 664.0 65.9 1 378.9 365.5 F 28.8 1.8 0.2 3.8 P<0.01 >0.05 >0.05 >0.05 28 h SS 19 101.8 1 369.7 901.1 1 749.4 19 225.6 42 347.6自由度 2 2 2 2 45 53 MS 9 550.9 684.9 450.6 874.7 427.2 F 22.4 1.6 1.1 2.0 P<0.01 >0.05 >0.05 >0.05 64 h SS 4 878.3 2 381.8 43.8 3 954.2 8 534.1 19 792.2自由度 2 2 2 2 45 53 MS 2 439.2 1 190.9 21.9 1 977.1 189.6 F 12.9 6.3 0.1 10.4 P<0.01 <0.01 >0.05 <0.01

為了確定正交試驗中3 種有顯著性影響的單糖的濃度效應，將單糖Man、Fuc 和Glc 按照濃度梯度水平和該水平幼蟲附著率均值作圖[17]。結果如圖2 所示，當Man 單糖濃度從5.00×10-8mol/L降到0.31×10-8mol/L，金星幼蟲附著率持續下降，呈現出Man 單糖濃度越高，幼蟲附著率越高的規律，因此Man 誘導金星幼蟲附著活性最強的濃度為 5.00×10-8mol/L（圖 2a）。Fuc 單糖濃度從 7.60×10-7mol/L 降到1.90×10-7mol/L，幼蟲附著率有所上升，再降至0.50×10-7mol/L 時，附著率則普遍下降，說明Fuc 在1.90×10-7mol/L 濃度時誘導金星幼蟲附著的活性最強（圖2b）。Glc 濃度從5.00×10-8mol/L 降到1.25×10-8mol/L，幼蟲附著率除了在64 h 時間點基本持平外，在其他時間點的幼蟲附著率略有上升，單糖濃度繼續降低至0.31×10-8mol/L，12 h 幼蟲附著率基本持平，其他時間點的幼蟲附著率持續上升，所以對Glc 而言，誘導幼蟲附著活性最強的濃度是0.31×10-8mol/L（圖2c）。因此設計誘導藤壺金星幼蟲附著的單糖組合時應優先考慮Man，且應選取最高濃度，Fuc 和Glc分別選取中間濃度和最低濃度，Xyl 的濃度則選取最低濃度即可。

圖2 藤壺金星幼蟲在三種單糖濃度下的附著率

2.3 藤壺金星幼蟲附著的動力學分析

將添加單糖的9 個正交試驗組和無單糖添加的對照組進行比較，分析藤壺金星幼蟲的附著動力學，計算各組的 t10、t30、t50和 t80[16]。結果如表 3 所示，從各附著時間數值看，除了第 1、2、3 組外，其余各組的數值均大于對照組，這意味著達到相同的幼蟲附著率比對照組需要的附著時間更長。在第 1、2、3 組中，t10、t30、t50和 t80最小的始終都是第 2組，也就是說第2 組金星幼蟲實現10%、30%、50%和80%附著率所需要的附著時間最短，只需3 h就能夠迅速實現10%的幼蟲附著，而對照組實現10%附著率需要8.4 h。第2 組快速啟動附著的優勢不斷積累，造成t50只需14.5 h，比對照組短9 h，t80保持了用時短的優勢，仍比對照組少5.5 h。因此，添加的單糖組合能加速金星幼蟲附著，使幼蟲附著的時間進程縮短。

表3 藤壺金星幼蟲附著的時間進程特征

3 討論

藤壺無節幼體變態成金星幼蟲后，不再攝食，此時幼蟲的主要職責就是尋找到合適的附著地點，成功變態完成種群的延續。金星幼蟲尋找附著地點時，需要化學信號的指引，這些信號包括SIPC 和環境中其他的水溶性信號分子。海洋生境中到處存在生物膜，能夠提供誘導藤壺等大型無脊椎污損生物幼蟲附著變態的信號。生物膜EPS 中的多糖成分，對于大型污損生物幼蟲的附著具有指引或者誘導作用，受到了普遍關注并不斷得到證實[9，18-20]。用凝集素LCA 特異性屏蔽SIPC 糖鏈結構中的特定單糖，發現SIPC 誘導幼蟲附著的活性喪失。凝集素LCA能特異性地和Glc、Man 結合，所以，糖鏈上的Glc和Man 可能是藤壺幼蟲感受SIPC 附著信號的識別位點[7-8]。而且Man 是SIPC 糖鏈的優勢單糖，在糖鏈上形成2~9 單體的聚合單元，另外糖鏈上還含有少量單個Fuc 和少數Man 單體形成的低聚單元[15]。因此有理由推測，單糖Man、Glc 和Fuc 可能與金星幼蟲對附著信號的識別有關。該研究的結果證實，單糖 Man、Glc、Xyl 和 Fuc 的組合對藤壺金星幼蟲的附著具有強烈的誘導效果。在這個組合中，4 種單糖的重要性有所不同。Man 單糖與藤壺金星幼蟲的附著密切相關，是4 種單糖中誘導附著活性最強的一種。4 種單糖中，只有Xyl 是五碳糖，Man 和Glc 都是六碳糖，比Xyl 具有更多的羥基，與金星幼蟲觸角的極性基團結合更緊密，可能因此導致誘導幼蟲附著的活性更強[19]。Man 具有強烈的誘導金星幼蟲附著的活性，最適濃度為5.00×10-8mol/L；Glc也能誘導幼蟲附著，最適濃度是0.31×10-8mol/L；Fuc 誘導金星幼蟲附著的活性很強，最適濃度是1.90×10-7mol/L，比 Man 和 Glc 的濃度略高；Xyl 在0.31×10-8mol/L 到 5.00×10-8mol/L 濃度之間沒有表現出明顯的誘導活性，這說明誘導活性除了和羥基數量有關以外，可能還與單糖濃度有關。大多數細胞外信號分子在非常低的濃度下起作用（通常為10-8mol/L），但識別它們的受體親和力不同，可能導致Xyl 需要更高的濃度[5]。因此，單糖的種類和濃度共同決定了金星幼蟲的附著情況。

該研究不僅考察藤壺金星幼蟲最終的附著率，還關注了幼蟲附著的時間進程，設置了不同的時間點觀察幼蟲的附著情況，并分析了藤壺金星幼蟲的附著動力學，對實現各附著率所需要的時間進行比較。結果發現添加合適濃度的單糖能極大地縮短藤壺金星幼蟲的附著時間，尤其是在幼蟲附著的早期階段，使幼蟲啟動附著的時間提前，單糖添加最優組達到10%金星幼蟲附著率的時間比沒有添加單糖的對照組提前了5.5 h，達到50%附著率的時間也縮短了9.0 h。這意味著添加合適種類和濃度的單糖，為金星幼蟲提供了適宜的附著信號，大大減少了幼蟲尋找和探索附著地點的時間。研究雙殼貝類白櫻蛤Macoma balthica 的面盤幼蟲在硅藻生物膜上的附著試驗結果表明，幼蟲的附著率和穴居率不僅與生物膜中的生物量和EPS 濃度密切相關，而且流水中的幼蟲附著率明顯低于靜水試驗，說明幼蟲快速附著對其成功繁衍的重要性[21]。在藤壺和養殖經濟無脊椎動物的實際生境中，縮短幼蟲的附著進程，盡早找到合適的附著地點并啟動附著程序，對于降低幼蟲病死率、提高種群繁衍成功率具有重要意義。