海水網箱養殖許氏平鲉細菌性疾病病原鑒定及致病性研究

李赟，許巖，陳文博，張賽賽，孫陽，丁勇

（大連市現代農業生產發展服務中心，遼寧 大連 116023）

許氏平鲉（Sebastes schlegeli）隸屬于鲉形目（Scorpaeniformes）、鲉科（Scorpaenidae）、平鲉屬（Sebastes），別名“黑頭”“黑石鱸”“黑鲪”，我國主要分布地區為黃渤海一帶。由于其具有耐寒能力強、生長速度快、肉質肥美等優點，成為北方海水網箱養殖中主要魚類之一[1-2]。大李家海域周邊是大連市大型海水網箱養殖的集中地之一，養殖的主要品種有紅鰭東方鲀、許氏平鲉等。近年來，隨著海水網箱養殖經濟效益的上升，該區域網箱養殖規模不斷擴大，疾病的發生也越來越頻繁，成為影響養殖成活率的關鍵因素。

此次許氏平鲉大規模染病現象于2019 年8 月出現在大李家街道近海海水網箱中，造成大多數許氏平鲉死亡。病魚的主要癥狀表現為：游動不規律，體表出現明顯創傷性潰瘍，鰭條潰爛，嚴重個體下顎潰爛，身體不能保持平衡等。經過現場取樣后，在患病的魚體內臟中分離出優勢菌株，并驗證該菌株的感染能力，從生化特性、形態特征等多個方面切入，確定了分離出的菌株為哈維氏弧菌，它同時也是其他諸多海水魚類流行性疾病的感染源之一[3-5]，筆者將分離得到的哈維氏弧菌進行藥物敏感性試驗，以期為許氏平鲉的健康養殖提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病許氏平鲉取自大連金石灘海域養殖個體戶，8 月中旬發病，發病魚體長15～25 cm，體表及鰭已明顯出血，尾部和下顎潰爛。100 尾健康許氏平鲉來自大連天正實業有限公司養殖基地，暫養于75 L水族箱，采用充氣泵增氧，體質量（25±2）g，體長（10±2）cm，每天進行 1 次吸污，2 次投餌，暫養過程中養殖海水鹽度嚴格控制在32‰，水溫控制在24 ℃。藥敏紙片、弧菌科細菌生化鑒定管以及TCBS、TSB、2216 E 培養基均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離

為排除寄生蟲和真菌感染，選擇典型的體表潰爛的許氏平鲉，在顯微鏡下觀察刮取到的潰爛處組織以及鰓和體表粘液。將病魚的尾部用酒精棉球擦拭，使用2.5 mL 無菌注射器采用靜脈取血的方式在尾部取血液0.5 mL，然后將血液涂布在平板上；用接種環劃取體表潰爛處，劃線接種于2216 E 平板；在無菌環境下取病魚的腎、脾、肝等組織，經磷酸鹽緩沖液研磨后，將研磨液同樣劃線接種于2216 E平板，培養溫度設置在28 ℃，孵育24 h。最后從菌群中選出形態一致的優勢菌落，對其純化培養三次得到純菌株，在-80 ℃下用TSB 凍存液（含15%甘油的TSB 培養基）保存。

1.3 人工感染試驗

選取70 尾健康魚用于回感試驗，試驗魚飼養于45 L 玻璃缸中，分成 7 組，每組10 尾，組別分配為空白組1 組、對照組1 組、試驗組5 組。試驗組在TSB 培養基培養24 h 后，使用無菌PBS 洗滌三次，使用0.85%NaCl 溶液調整菌懸液的密度至3×107CFU/mL[6]。用生理鹽水對該菌懸液進行梯度稀釋后分別制成濃度為 3×106CFU/mL、3×105CFU/mL、3×104CFU/mL、3×103CFU/mL 的菌液。感染試驗采用腹腔注射方式進行，試驗組每尾注射0.1 mL 菌液，對照組注射等量無菌PBS，空白組不注射。處理后每天對許氏平鲉的死亡和發病狀況進行觀察，并按照正常飼養條件進行吸污和換水，將觀察到的結果記錄下來，同時取出具有自然患病癥狀的人工感染發病許氏平鲉，再次對細菌進行分離和純化。

1.4 病原形態與生理生化鑒定結果

采用劃線接種，在TCBS 和2216 E 平板上接種純化細菌，并在28 ℃下培養，孵育24 h 后，從理化特性和形態學等水平測定分離菌株的相應指標。依據文獻[7-8]的方法對理化特性進行測定，即采用革蘭氏染色法對供試菌進行涂片、染色，然后鏡檢供試菌的形態。

1.5 分子生物學鑒定

模板DNA 的制備：將待測細菌單菌落（純培養）置于50 μL 無菌去離子水中，沸水煮5 min，放置在冰上冷卻后瞬間離心，取上清液用作PCR 擴增。使用文獻[9]中的方法進行16 S rRNA 基因序列的PCR 擴增與測序，擴增產物送至天津華大基因科技有限公司進行測序。使用NCBI 的Blast 檢索系統確定16 S rRNA 基因序列的同源基因。通過以上方法確定了同源性較高的菌株，使用Clustalx 軟件將其與所得菌株16 S rRNA 基因的序列比對后構建系統發育樹，并進行置信度檢測，檢測1 000 次。

1.6 藥物敏感試驗

根據美國NCCLS 試驗標準方法[10]，測定14 種抗生素對于分離菌株是否有效，使用K-B 法測定分離菌株的敏感性。使用28 ℃培養箱培養營養肉湯中的菌株，并將菌液的濃度調整到3.0×107CFU/mL，培養24 h。在MH 瓊脂上均勻涂布150 μL 菌液，使用各種藥敏紙片，在28 ℃下孵育24 h，測量抑菌圈直徑大小，對照藥敏紙片說明確定該菌株對于各種抗菌素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 病魚檢查

患病魚體表潰瘍，鰭條略有潰爛。解剖病魚發現腸有少量積水，顏色較淺。在對病灶、鰓以及粘液等組織鏡檢后，并未發現真菌和寄生蟲；病灶、腎、肝、腸在透射電鏡下未見病毒粒子。

圖1 患病許氏平鲉體表潰瘍

2.2 致病性驗證

感染試驗共進行10 d，以注射結束后24 h 計為1 d。如圖 2 所示，3×107CFU/mL、3×106CFU/mL、3×105CFU/mL 試驗組的許氏平鲉均在注射菌液2 d后出現死亡。其中，3×107CFU/mL 組在第4 天全部死亡，3×106CFU/mL 組在第 5 天全部死亡，3×105CFU/mL組在第7 天全部死亡。注射菌液濃度為3×104CFU/mL的試驗組，培養4 d 后開始發現死亡，至試驗結束，累計70%死亡；菌液濃度為3×103CFU/mL 病死率為30%。從生理活動來看，人工感染后的許氏平鲉游動遲緩、攝食量減少，死亡魚的體表存在出血點和潰瘍，部分還會出現腹水，與自然感染無異。相比之下，空白組和對照組均無死亡和異常。采用劃線接種的方法在TCBS 平板上接種人工感染后發病的瀕死魚腹水及內臟分離菌株，通過形態和理化特性分析，新分離株和原感染菌株基本一致。利用李長紅等[11]改良的寇氏法，可以得到菌株BN-1910 對許氏平鲉 10 d 的 LD50 為 7.98×103CFU/mL。

圖2 人工感染試驗結果

2.3 病原菌的形態觀察

在患病許氏平鲉的病灶中分離出一株優勢菌株，命名為BN-1910。對此菌株分離純化，并在28 ℃下使用TSB 瓊脂平板培養，觀察培養18~24 h 后的菌落形態，如圖3 所示，可以發現其直徑多在2 mm 左右，從中央略隆起，表面光滑，呈半透明圓形。該菌株能夠在TCBS 培養基上生長，菌落呈短棒狀，表現為黃色、隆起、邊緣整齊、圓形光滑，革蘭氏染色陰性。

2.4 病原菌理化特征

理化特性見表1。

圖3 菌株在TCBS 平板上的菌落形態

表1 生化反應結果

注：“＋”表示陽性，“－”表示陰性；“F”表示發酵；“d”表示結果為陽性或陰性均有。

2.5 16S rRNA 基因序列分析及系統發育樹構建

使用PCR 擴增所分離菌株BN-1910 的16S rRNA基因序列，測序后獲得1 449 bp 的DNA 片段。將測序所得序列提交至NCBI 進行BLAST 分析，以16S rRNA基因構建的系統發育樹顯示，菌株BN-1910 與哈維氏弧菌聚為一支，置信度99%（圖4）。由以上結果出發，可以判斷菌株為哈維氏弧菌。16S rRNA 基因序列與MT864681.1 比對情況如圖5 所示。

圖4 菌株BN-1910 的系統發育樹分析

圖5 16S rRNA 基因序列與MT864681.1 部分比對結果

2.6 藥敏特性

抗生素敏感性測試的結果如表2 所示。由表可知，分離菌株對左氧氟沙星、鏈霉素和氟哌酸高度敏感，對氟羅沙星、慶大霉素和卡那霉素中度敏感，對另外八種抗生素不敏感。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

海水魚類網箱養殖成為捕撈漁民轉產轉業、漁業結構調整的優先發展產業。許氏平鲉是大連海域常見魚類，本地海洋牧場重點增殖魚類，也是大連市增殖放流品種之一，它已成為我市重要的海水網箱養殖魚類。近幾年，大連市許氏平鲉養殖規模逐漸擴大，集約化程度不斷提高，但疾病防控水平受限，同時投喂冰鮮餌料存在潛在細菌污染[12]，許氏平鲉發病時有發生[13]，給養殖企業造成了一定的經濟損失，阻礙了網箱養殖產業健康發展。

目前日本、韓國許氏平鲉養殖有較多關于細菌性疾病報道，說明細菌性疾病是影響許氏平鲉網箱養殖的關鍵因素。這些報道中涉及的弧菌包括奧氏弧菌（V.ordalii）、創傷弧菌（V.vulnf icus）、溶藻膠弧菌（V.alginolyticus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）等[14]。許氏平鲉受弧菌感染后主要表現有體色發黑、表皮充血紅腫，游動不規則，攝食差，嚴重時肌肉腐爛，此次金州區患病魚發病特征與弧菌病十分相似。本研究通過分離病魚病灶獲得優勢菌，并利用感染試驗證明其對于許氏平鲉的致病力。從生理生化、形態特征和16S rDNA 基因序列比對后確定了該菌株為哈維氏弧菌。有報道表明哈維氏弧菌能感染大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[15]暴發潰瘍病，病魚出現體表出血、肌肉潰爛、眼球凸出癥狀，部分特征與本研究病魚高度相似。受哈維氏弧菌感染的黑鯛（Sparus macrocephalus）[16]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[4]也出現類似患病特征。哈維氏弧菌相關研究發現其胞外產物有多種活性酶類物質，其中分子量約38 kDa 的蛋白酶對鯽（Carassius auratus）有致死毒性[17]。

藥敏試驗表明分離菌株對左氧氟沙星、鏈霉素和氟哌酸高度敏感，對氟羅沙星、慶大霉素和卡那霉素中度敏感。藥敏試驗結果對哈維氏弧菌的防治有參考價值，患病初期的魚體可嘗試選用氟哌酸、鏈霉素和左氧氟沙星藥浴進行防治。疾病的預防最為主要，黃輝等[18]研究顯示重組哈維氏弧菌外膜蛋白OmpU 具有良好的免疫原性, 可作為亞單位疫苗的開發對象。