外周血淋巴細胞亞群、細胞因子在未足月胎膜早破孕婦中水平變化及與絨毛膜羊膜炎發生的相關性研究

劉會雪，尹紅亞，童重新，何瑞芝，高 芳

胎膜早破(premature rupture of membrane， PROM)是指臨產前發生的胎膜破裂，是妊娠期常見并發癥，發生率為3.3%～21.9%[1]。未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membrane， PPROM)即發生在妊娠37周前的PROM，是引起圍生期婦女不良妊娠結局的重要原因[2]。導致PROM及早產的因素較多，其中感染是最主要的原因。絨毛膜羊膜炎即妊娠期宮腔內胎兒及其附屬物被病原微生物侵入所致，研究發現，絨毛膜羊膜炎發生時，羊水內炎性細胞因子水平較無感染者顯著升高，故應用檢測細胞因子的方法來早期診斷絨毛膜羊膜炎引起相關學者的關注[3]。此外，T、B淋巴細胞亞群也是近年來免疫學研究的熱點，其對感染性疾病的輔助診斷、療效評估及預后監測均有重要意義[4]。本研究就外周血T、B淋巴細胞亞群及細胞因子在PPROM孕婦中的水平變化及與絨毛膜羊膜炎發生的相關性進行研究，旨在為臨床診療提供思路，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2019年12月于本院就診的PPROM孕婦，納入標準：①滿足PROM診斷標準[5]；②孕周26～37周；③入院時未臨產，破膜時間<72 h者；④臨床資料完整且真實者。排除標準：①合并高血壓病、心臟病、糖尿病等病史；②機械性損傷、心臟病、雙胎、胎位異常等原因所致的PROM者；③入院前7 d內應用抗菌藥物者；④失訪及實驗室檢查異常者。根據納入及排除標準共選取50例為研究組，其中21例并發絨毛膜羊膜炎為絨毛膜羊膜炎組，29例未并發絨毛膜羊膜炎為無絨毛膜羊膜炎組。同時選取同期未發生PROM孕婦50例為對照組。研究組和對照組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經醫院倫理委員會批準執行。

表1 未足月胎膜早破和未發生胎膜早破兩組孕婦一般資料比較

1.2研究方法 收集研究對象臨床資料，包括年齡、孕產史、入院時白細胞計數、入院時體溫、潛伏期時間(膜破裂至分娩的時間)、羊水過少(羊水量<30 ml)等；檢測兩組外周血T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、CD56)、B淋巴細胞亞群(CD19+)和細胞因子[Th1型細胞因子γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，Th2型細胞因子白細胞介素(IL)-6]含量。

1.3檢測方法

1.3.1淋巴細胞亞群檢測：抽取所有受檢者入組時清晨空腹靜脈血3 ml，置入EDTA-K2抗凝管，3000 r/min離心10 min取上清液。由專業技術人員嚴格按照說明將標準量的抗體抽取放置于流式管中，加入100 μl已混勻的全血并漩渦混勻放置于避光處15 min，將BD溶血素1.5 ml溶入流式管并于避光處孵育10 min直至完全溶解透亮，磷酸緩沖鹽(PBS)溶液洗滌1次并離心，棄上清液后再次加入PBS溶液洗滌2次，洗滌完成后加入1%固定液600 μl上機待檢。應用FACSCalibur型流式細胞儀進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。

1.3.2細胞因子：抽取所有受檢者入組時清晨空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min取上清液，采用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-6、IFN-γ、TNF-β水平，試劑盒購自美國BD公司。

1.4絨毛膜羊膜炎診斷標準[6]①孕婦體溫>38.0℃，并排除其他感染存在；②孕婦白細胞計數≥15×109/L；③孕婦心動過速，心率>100/min，并排除心臟疾病及藥物因素；④胎兒心動過速，胎心基線>160/min，排除臍帶繞頸等因素；⑤子宮壓痛；⑥羊水惡臭。①為基本條件，再合并以上任何1項陽性體征即可診斷為臨床絨毛膜羊膜炎；無明顯臨床癥狀和體征，僅實驗室指標異常診斷為亞臨床絨毛膜羊膜炎。

2 結果

2.1兩組外周血淋巴細胞亞群、細胞因子水平比較 研究組CD4+、CD8+、CD19+及IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較對照組高，CD56水平較對照組低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 未足月胎膜早破和未發生胎膜早破兩組孕婦外周血淋巴細胞亞群及細胞因子水平比較

2.2影響PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的單因素分析 兩組年齡、經產人數、入院時白細胞計數、入院時體溫比較差異無統計學意義(P>0.05)；絨毛膜羊膜炎組潛伏期時間長于無絨毛膜羊膜炎組，羊水過少人數多于無絨毛膜羊膜炎組，CD4+、CD8+、CD19+、IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較無絨毛膜羊膜炎組高，CD56水平較無絨毛膜羊膜炎組低，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 影響未足月胎膜早破患者并發絨毛膜羊膜炎的單因素分析

2.3影響PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的多因素分析 CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β水平異常及羊水過少是PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的獨立危險因素(P<0.05或P<0.01)，見表4。

表4 影響未足月胎膜早破患者并發絨毛膜羊膜炎的多因素分析

2.4外周血淋巴細胞亞群和細胞因子對PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的預測價值分析 采用ROC曲線分析CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β及聯合檢測對PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的預測價值，結果顯示CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β及聯合檢測曲線下面積分別0.828、0.878、0.873、0.755、0.900、0.864、0.957、0.999，以聯合檢測曲線下面積最大，見圖1。提示聯合檢測對PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的預測價值最高。

圖1 外周血淋巴細胞亞群和細胞因子對未足月胎膜早破患者并發絨毛膜羊膜炎的受試者工作特征曲線 IL-6為白細胞介素-6,IFN-γ為γ干擾素，TNF-β為腫瘤壞死因子-β

3 討論

PROM病因較為復雜，發病機制尚不十分清楚，可能是多種風險因素作用導致的產科并發癥，如炎癥細胞因子、營養因素、基因多態性、氧化應激、細胞凋亡等[7]。在PROM患者中，絨毛膜羊膜炎的發生率較高，本研究中50例PPROM患者絨毛膜羊膜炎發病率為42.00%，與既往研究相似[8]。絨毛膜羊膜炎有著不同的發展階段。首先，絨毛膜羊膜炎引起母體炎性反應，表現為羊膜腔感染綜合征，稱亞臨床性感染；隨著感染的進一步蔓延，引起胎兒炎性反應，新生兒感染后易發生多種并發癥如新生兒腦損傷等，可危及生命[9]。因此，如何對PROM并發絨毛膜羊膜炎進行早期診斷，選擇最適宜的時機、最合適的途徑終止妊娠，為是否延長孕周提供證據，對減少母嬰圍生期并發癥的發生至為重要[10]。

3.1細胞因子在PPROM孕婦中水平變化及與絨毛膜羊膜炎并發的相關性 研究認為，妊娠成功的必備條件之一是母體與胎兒間的免疫相容[11]。輔助性T(Th)細胞的功能性分化是免疫學研究的熱點之一，Th細胞分化后產生Th1/Th2兩種不同細胞因子的調節機制也開始用于解釋母胎界面的細胞調節現象[12]。而近年來對Th1/Th2細胞因子的研究表明：正常妊娠Th2型細胞因子占優勢，即妊娠期母體是趨向于Th2型細胞因子為優勢參與的體液免疫，Th1型細胞因子參與的細胞免疫則處于劣勢狀態[13]。一般情況下，Th1和Th2型細胞分化與功能相互制約，Th1/Th2處于動態平衡。在某些狀態下，Th1/Th2的動態平衡狀態被打破，而造成偏向Th1或Th2的優勢應答，進而引起感染性疾病、過敏性疾病、病理性妊娠等的發生[14]。

研究表明，在早產和PROM孕婦羊水、胎盤中均有細胞因子的異常表達[15]。Lai等[16]用酶聯免疫吸附法檢測了早產、PROM組IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12的表達，結果Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ及IL-1水平在早產、PROM組中顯著增加，而Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10在正常妊娠足月婦女中顯著增加，這些數據表明在早產、PROM婦女中存在Th1偏移現象。本研究結果顯示，研究組IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較對照組高，且絨毛膜羊膜炎組IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較無絨毛膜羊膜炎組高，證明細胞因子異常與PPROM發生關系密切，且參與并發絨毛膜羊膜炎的炎性過程。而在多因素Logistic分析中顯示，各項細胞因子異常作為PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的獨立危險因素，進一步提示分娩前聯合檢測母血細胞因子含量，可增加并發絨毛膜羊膜炎檢出準確率。

3.2淋巴細胞亞群在PPROM孕婦中水平變化及與絨毛膜羊膜炎并發的相關性 淋巴細胞中的T細胞執行特異性細胞免疫和調節功能，在人體免疫系統中發揮著重要作用[17]。其中，CD4+和CD8+是T淋巴細胞亞群重要的組成部分。CD4+具有促進B細胞、T細胞和其他免疫細胞增殖與分化的功能；CD8+是抑制免疫應答的活化劑，具有細胞毒作用，可抑制和殺傷T細胞和靶細胞，為殺傷性T細胞。正常情況下，CD4+和CD8+保持一定的比例,當二者數量發生變化，可導致細胞免疫功能紊亂和免疫失調，從而導致疾病的發生。而CD56是一組相關的細胞表面糖蛋白，在胚胎發生發育以及神經細胞的相互聯系中發揮重要的作用[18]。CD56在子宮內膜自然殺傷細胞上表達，通過計算患者體內CD56的數量，可對其內膜免疫狀態進行評估。此外，CD19+為一種簇分化抗原，是B細胞增殖、分化、活化及抗體產生的重要膜抗原[19]。本研究發現，研究組CD4+、CD8+、CD19+、CD56水平在PPROM患者中均顯著異常；同時，絨毛膜羊膜炎組CD4+、CD8+、CD19+水平較無絨毛膜羊膜炎組高，CD56水平較無絨毛膜羊膜炎組低，證明淋巴細胞亞群在PPROM及絨毛膜羊膜炎的發病機制中起重要作用。進一步利用ROC曲線分析CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β及聯合檢測對PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的預測價值，結果顯示各指標曲線下面積以聯合檢測最大，提示聯合檢測外周血T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞亞群及細胞因子可作為預測PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的有效手段。

綜上，外周血T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、CD56)、B淋巴細胞亞群(CD19+)及細胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-β)水平在PPROM患者中異常表達，其為PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的獨立危險因素，聯合檢測各指標可作為判斷PPROM患者并發絨毛膜羊膜炎的指標。