二十二碳六烯酸介導MAPK途徑抗房顫的作用及機制研究

徐慶梅，莫 辰，朱飛宇，張 恒，王洪巨，高 琴，康品方，唐 碧

心房顫動(atrial fibrillation，AF)簡稱房顫，主要表現為心臟迅速而又不規則地跳動，是臨床上最常見的一種心律失常，其發病率及致死率居高不下，危害性堪比惡性腫瘤，嚴重影響病人的生命質量[1]。心房纖維化的特征在于心肌成纖維細胞異常增殖所致的心肌細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的異常積累[2]，它作為AF發生的觸發器，可引起心房電傳導異常，更易形成折返，有利于AF的發作和維持，是AF發生、發展的病理基礎[3]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)屬于ω-3多不飽和脂肪酸家族中的重要成員，在膳食魚類中廣泛存在。研究[4]表明，增加多不飽和脂肪酸的攝入可有效降低冠心病和心血管疾病事件發生的風險。最新研究[5]也證實，多不飽和脂肪酸可發揮抗AF的作用。絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶(mitogen activates protein kinase phosphatase,MKP-1)是一種蘇氨酸/酪氨酸磷酸酯酶，可調控絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)及P38磷酸化狀態。正常情況下，MAPKs和MKP-1處于動態平衡狀態，這種平衡狀態在決定細胞生存或凋亡方面起重要作用[6]。另有研究[7]發現,MAPK通路可介導成纖維細胞的增殖和遷移。而DHA是否通過影響P38 MAPK通路發揮抗AF的作用尚未見報道。本研究觀察DHA對大鼠心房纖維化的影響，并探討該作用是否與調控P38 MAPK通路介導的膠原表達有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SD雄性大鼠80只，體質量(220±20)g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。氯化乙酰膽堿購于Sigma公司，單克隆鼠抗P38、P-P38、MKP-1抗體及β-actin 抗體均購于Santa Cruz公司，單克隆二抗購自武漢博士德公司；大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原ELISA試劑盒購于上海慧嘉生物公司，PBS購于Hyclone公司，其余試劑均為國產分析純級別。MedLab生物信號采集處理系統(U/4C501H)購于南京美易科技有限公司，低溫高速離心機(5810R)于德國Eppendor公司購買，膜片鉗相關儀器設備由美國Axon公司提供，免疫印跡配套設備購于美國BIO-RAD公司。

1.2 AF動物模型制備與分組

1.2.1 大鼠初篩與分組 雄性SD大鼠適應性喂養1周后，尾靜脈注射[8]66 μg/mL乙酰膽堿與50 mg/mL氯化鈣混合液，心電圖(標準Ⅱ導聯)全程記錄。剔除乙酰膽堿-氯化鈣混合液不敏感大鼠，最終選擇80只，隨機分為對照組(CON組)、對照DHA處理組(DHA組)、AF組和AF+DHA處理組(DHA+AF組)，每組20只。

1.2.2 AF模型復制 AF模型組連續3 d尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液，每天給藥1次，Ⅱ導心電圖顯示P波消失、出現f波的典型AF心電圖視為模型復制成功[8]。

1.2.3 分組干預處理 第4天開始，CON組給予0.9%氯化鈉溶液，DHA組給予DHA溶液(10 mg/mL)和0.9%氯化鈉溶液，AF組給予0.9%氯化鈉溶液和乙酰膽堿-氯化鈣混合液，DHA+AF組給予DHA溶液和乙酰膽堿-氯化鈣混合液，給藥方式均為尾靜脈注射，給藥劑量均為0.1 mL/100 g，每天給藥1次，連續14 d。

1.3 AF持續時間測定 參照陳春林團隊的建模方法[8]，實驗第3、4、10、17天記錄給藥前后心電圖，以P波消失、f波出現為AF發生標志；竇性心律恢復、P波復現、f波消失為AF終止標志，AF發生至終止所持續的時間即為AF持續時間。

1.4 大鼠心房有效不應期(ERP)測定 實驗第18天，脫頸法處死SD大鼠后，迅速開胸取出心臟，剪取左心房肌條固定于持續通以混合氣體(95%O2+5%CO2)的含有K-H液的浴槽，調節前負荷為1g，穩定40 min，采用連續雙刺激法測定心房肌ERP。

1.5 大鼠心房肌細胞動作電位時程(APD)測定 采用改良的酶解法分離出大鼠心房肌細胞，選取富有活力、靜止、桿狀、橫紋清晰的細胞，應用電流鉗方法引發心肌細胞動作電位，全細胞膜片鉗技術記錄復極50%時的動作電位時程(APD50)、復極90%時的動作電位時程(APD90)。

1.6 ELISA檢測大鼠心房肌組織膠原表達 剪取的心房組織剪碎后置于研缽中，加入1 mL 4 ℃預冷的PBS快速研磨至未見明顯的組織塊，2 000 min，離心10 min后取上清，按照試劑盒中的方法，使用酶標儀在450 nm波長下檢測并記錄各組OD值。

1.7 心房肌MAPK信號通路蛋白表達 提取心房組織總蛋白，使用BCA法蛋白定量后，經SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉法轉膜、5%脫脂奶粉封閉、分別用單克隆抗體P38(1∶500)、P- P38(1∶500)、MKP-1(1∶500)4 ℃孵育過夜、二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h后ECL顯色照相。采用 Bio-Rad quantity one對目的條帶進行半定量分析。

1.8 統計學方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 大鼠AF心電圖 大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液1～2 s后即出現典型的AF心電圖(見圖1)。

2.2 DHA對大鼠AF持續時間的影響 CON組和DHA組尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液，給藥前后心電圖無明顯變化，未見典型AF心電圖。AF組和DHA+AF組通過觀察心電圖，結果顯示隨著實驗時間的增加，AF大鼠的AF持續時間逐漸延長，實驗第4、10、17天，與AF組相比，DHA+AF組大鼠AF持續時間明顯縮短(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 AF組與DHA+AF組大鼠AF持續時間比較

2.3 DHA對大鼠心房肌ERP影響 與CON組大鼠相比，AF組ERP明顯縮短，DHA組及DHA+AF ERP組延長(P<0.01)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠ERP明顯延長(P<0.01)(見表2)。

表2 各組大鼠心房肌ERP比較

2.4 DHA對大鼠心房肌細胞APD影響 與CON組相比，AF組大鼠心房肌細胞APD50和APD90明顯縮短(P<0.01)，DHA組與DHA+AF組延長(P<0.01)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠心房肌細胞APD50和APD90延長(P<0.01)(見表3、4)。

表3 DHA對大鼠心房肌細胞APD50的影響

表4 DHA對大鼠心房肌細胞APD90的影響

2.5 DHA對大鼠心房肌膠原表達影響 與CON組相比，AF組Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達明顯增高(P<0.01)，DHA組Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達明顯降低(P<0.01)；與AF組相比，DHA、DHA+AF組Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達均明顯降低(P<0.01)(見表5、6)。

表5 DHA對大鼠心房肌Ⅰ型膠原表達的影響

表6 DHA對大鼠心房肌Ⅲ型膠原表達的影響

2.6 DHA對大鼠心房肌MAPK信號通路蛋白表達影響 各組P38表達無明顯變化，與CON組相比，DHA組P-P38表達明顯下降，MKP-1表達明顯增加(P<0.01)；AF組P-P38表達明顯增高，MKP-1表達明顯降低(P<0.01)；與AF組相比，DHA+AF組P-P38表達明顯下降，MKP-1表達明顯增加(P<0.01)(見表7、8)。

分組P-P38/P38FPMS組內CON組0.60±0.05##AF組DHA組0.82±0.04**▲▲0.56±0.46## 3.03 <0.05 0.054DHA+AF組 0.71±0.03**##▲▲

項目分組MKP-1/β-actinFPMS組內CON組0.70±0.06##▲▲AF組DHA組0.46±0.04**▲▲0.87±0.06**##125.90 <0.01 0.003DHA+AF組 0.75±0.05##▲▲

3 討論

AF是一種進行性、自我持續性心律失常，AF及其并發癥成為一個日益嚴重的臨床問題[9]。本實驗通過復制AF模型發現：與CON組相比，AF組大鼠AF持續時間隨實驗時間增加而逐漸延長，心房ERP、APD50及APD90明顯縮短，心房組織P-P38蛋白、Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達水平明顯升高，MKP-1表達下降；DHA干預組AF持續時間較AF組明顯縮短，以實驗第10、17天尤為顯著，在有效延長心房ERP、APD50及APD90的同時還下調了P-P38、Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達水平，而MKP-1水平較前增加。這些結果表明，DHA可能通過調控P38 MAPK通路發揮抗AF作用。

AF的一個顯著特征是心房結構重構，而心房纖維化的形成是導致AF病人心房結構重構的主要因素之一。研究證實[10]，ECM參與了心房重塑過程，心臟成纖維細胞分泌的膠原在ECM的形成中起著關鍵作用。多種膠原在ECM中表達并參與促纖維化反應，Ⅰ型膠原約占心肌膠原的80%～90%，Ⅲ型膠原則與AF復發率獨立相關，當組織受到刺激時，心肌成纖維細胞過度增殖，各型膠原合成和分泌增加，降解減少，發生膠原過度聚集，即ECM重構[10]。本研究發現，與CON組相比，AF組大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達明顯增高，提示AF的發生伴隨著心肌纖維化程度加重；與AF組相比，給予DHA治療后，大鼠心房Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達顯著降低，提示DHA可通過改善膠原成分比例減輕纖維化，抑制心房重構。

2009年的一項研究[11]表明，魚油補充劑中的DHA不僅有助于健康人群的心血管疾病預防，而且可減少心臟病病人的心臟事件和死亡率。近年來，DHA在防治AF方面的作用日益受到關注。流行病學隨訪研究發現，膳食魚類的人群與AF的低發病率密切相關[12],RAMADEEN等[13]在狗的AF模型中的研究發現DHA可以降低心房纖維化的程度進而抑制AF的發生、發展。本實驗發現，通過DHA干預可顯著縮短AF持續時間，還可有效延長心房ERP、APD50及APD90，降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達，與RAMADEEN等的結果一致，提示DHA可有效減輕AF大鼠心肌纖維化。

MAPKs是細胞內的一類絲氨酸和(或)蘇氨酸激酶，是細胞應激和炎癥反應的主要信號通路，MAPK的活性受MKP負調控，MKP-1缺乏可導致應激反應中P38 MAPK通路活化增強[14]。在小鼠肌少癥肥胖模型中發現，多不飽和脂肪酸對P38 MAPK信號通路所介導的骨骼肌細胞凋亡和細胞分化減少有保護作用[15]。相關研究[16]顯示，多不飽和脂肪酸在保護心肌缺血再灌注損傷中具MAPK-1依賴性。有實驗[17]證明，P38 MAPK的激活可顯著增加AF的易感性。本實驗發現，與CON組相比，DHA處理組P-P38表達明顯下降，MKP-1表達明顯增加(P<0.05)；與AF組相比，DHA+AF組P-P38表達明顯下降，MKP-1表達明顯增加。心房肌組織P38 MAPK 活性的逐漸增高與MKP-1 表達相對下降呈顯著負相關關系，這與文獻[14]中報道的一致。本研究發現，在各組大鼠中，P-P38蛋白的表達與Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達趨勢一致，提示DHA不僅降低了P38的表達，還可降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達，結合我們課題組前期研究[18]，本實驗中DHA 可改善AF心房肌纖維化，其機制可能與激活P38 MAPK通路密切相關。

值得注意的是，心房重構包括了結構重構和電重構，后者[19]主要指AF時節律快而不規則的心房激動造成的心房組織電生理特性的改變，常表現為ERP和APD一致性縮短。本實驗中，與CON組大鼠相比，AF組大鼠ERP、APD50及APD90均表現為同步縮短，使用DHA干預后ERP、APD50及APD90均得到一致有效延長，提示DHA可能還發揮對抗AF大鼠的心房電重構作用，其具體作用機制有待下一步深入研究。關于P38 MAPK通路與DHA的攝入鮮有報道，本研究初步證明DHA具有抗心房纖維化作用，該作用的實現可能與P38 MAPK通路調控的膠原表達有關，將為AF病人臨床治療的研究提供新的方向，但具體機制仍需進一步探討。