白血病的分子診斷技術研究進展*

姜慧慧，弭苗苗，辛 鈺 綜述，孫成銘 審校

1.青島大學，山東青島 266000；2.濱州醫學院，山東煙臺 264000；3.青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院檢驗中心，山東煙臺 264000

白血病是一種起源于造血干細胞的惡性增殖疾病，其特征是骨髓異常分化的原始細胞克隆性擴張。近年來，在白血病患者中發現了越來越多的細胞遺傳學和分子遺傳學標志物異常，突顯了這種疾病的生物學異質性。大多數白血病都有某種染色體易位，而染色體易位會導致新的融合基因產生、癌基因的擴增、原癌基因點突變和抑癌基因的失活等。2016年，WHO對白血病提出了新的診斷與分型標準，更加突出了分子生物學在白血病診斷和治療中的作用[1]。詳細的分子標志物監測對于白血病患者的治療和預后評估至關重要，特別對于初步治療后和長期隨訪期間監測微小殘留病變(MRD)極其重要。近年來，隨著各種分子生物學技術的不斷發展，分子生物學檢測在白血病診治中的作用越來越重要。本文針對白血病的分子診斷技術的研究進展進行總結，以便更好地了解各種分子診斷技術，方便臨床醫生選擇更合適的分子診斷方案。

1 染色體檢測

白血病患者常伴有特征性的染色體改變，根據2016年WHO的分類，一些急性髓系白血病(AML)亞型是通過存在以下染色體或者分子異常來定義的，如t(8；21)(q22；q22)(RUNX1-RunX1T1)、inv(16)(p13.1q22)或t(16；16)(p13.1；q22)(CBFB-MYH11)、急性早幼粒細胞白血病(APL)合并PML-RARA等[2]。慢性粒細胞白血病(CML)患者的染色體檢測常見由t(9；22)(q34；q11)易位引起的Ph染色體[3]。

1.1染色體核型分析 目前，染色體核型分析是評估染色體改變的常規檢測方法，G顯帶技術操作簡單，帶紋清晰，染色體標本可長期保存，因此，被廣泛用于染色體異常的診斷和研究，該技術一直是實驗室診斷AML和判斷預后的金標準方法，但其在靈敏度和特異度上存在一定的局限。

1.2熒光原位雜交(FISH) FISH技術是一種更直接的方法，將熒光標記的探針與特定的染色體序列結合，然后通過顯微鏡進行評估，根據探針的設計，可以識別染色體的結構或數字變化，該技術的主要優點是不依賴于細胞分裂，因此可以對處于細胞分裂間期的細胞進行分析。FISH的分辨率比傳統的核型分析高，有助于檢測隱蔽或復雜的易位，但其不能檢測到同一條染色體上小片段的插入和缺失等異常，這些都需要結合其他分子技術來判斷[4]。多重染色體異常的檢測常使用多色熒光原位雜交(M-FISH)技術，M-FISH技術是用顏料來識別單個中期染色體，能有效解決復雜的核型或形態不佳的中期染色體擴散問題，因為這些染色體僅通過G顯帶技術是很難識別的[5]。

1.3基因芯片 基因芯片又稱染色體微陣列技術(CMA)，基于陣列的比較基因組雜交(CGH)和單核苷酸多態性(SNP)的CMA比傳統核型分析分辨率更高，該技術能夠更精確地識別染色體斷裂點和基因異常，在具有特殊特征的白血病或復發的難治性AML中，CMA可以發現隱匿的染色體改變，它的結果通常與傳統的核型分析結果是互補的。CGH將來自白血病患者的遺傳物質與正常個體的遺傳物質進行比較，以確定測試標本中是否存在拷貝數變化[6]。由于慢性淋巴細胞白血病(CLL)已知的遺傳損傷是染色體上基因片段的重復與丟失，所以CLL就非常適合用拷貝數陣列進行分析[7]。SNP陣列的引入進一步提高了微陣列技術的分辨率，SNP陣列可以在全基因組水平上進行評估，并識別出拷貝數變異非常小的區域。拷貝中性雜合性缺失(CN-LOH)在白血病，特別是AML中是一種常見的染色體異常，SNP陣列能夠檢測CN-LOH，除了測量拷貝數外，它還能提供基因分型信息[5]。與常規細胞遺傳學分析相比，CMA的主要局限性是無法識別白血病中平衡的染色體重排，由于重排和融合基因在某些血液系統惡性腫瘤中對判斷預后具有重要的意義，因此，有必要使用FISH或測序技術來補充CMA，并且CMA的成本相對較高，盡管該方法普遍可用，但由于目前尚無指導方針，CMA檢測在各機構的診斷實驗室中并不是常規方法。

2 融合基因檢測

融合基因主要通過染色體重排或異常轉錄產生，許多白血病亞型中會檢測到相當數量的融合基因，且部分融合基因是具有重要價值的診斷工具和治療靶標[8]。如t(15；17)(q22；q21)和t(9；22)(q34；q11)染色體易位會形成PML-RARα融合基因和BCR-ABL1融合基因，這是診斷APL和CML的重要指標[2]。

2.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 目前，PCR是檢測白血病融合基因常用的敏感而有效的方法。反轉錄PCR(RT-PCR)能夠在擴增反應完成后對產物進行評估，可提供對特定產物如融合基因的定性評估，但現在已在很大程度上被其他定量技術所取代[5]。RT-qPCR是現在被廣泛使用的定量技術，RT-qPCR測量白血病融合基因的歐洲標準化方案已于2003年公布，該技術是在PCR擴增過程中，通過熒光信號對PCR進程進行實時監測，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。RT-qPCR能夠快速檢測，并且具有較高的靈敏度和特異度，通常還被用來監測MRD。RT-qPCR檢測融合基因對于臨床上白血病的分型、預后評估、選擇治療方案等都具有重要價值，是目前臨床上應用最廣泛的定量方法之一[9]。

2.2數字PCR(DPCR) DPCR代表了PCR的創新發展，與RT-qPCR相比具有許多實用優勢，精密度高，重復性好，不需要標準曲線的循環閾值進行定量，可以實現絕對定量分析[10]。有研究證實了DPCR在許多血液惡性腫瘤中監測MRD的可行性，目前，這一技術的主要缺點是成本仍然高于標準的RT-qPCR，缺乏標準化的檢測程序，以及配備DPCR儀器的實驗室數量有限，因此，并未應用到臨床常規檢測中[11]。近年來，DPCR技術繼續發展形成了微滴式數字PCR(DDPCR)技術，DDPCR是第三代PCR技術，這種方法是在PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將DNA模板分子分割成約20 000個油包水液滴，每個微滴不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，含有熒光信號的液滴被判斷為陽性。該技術已被應用于各種臨床標本的等位基因定量、突變檢測、拷貝數變異分析、DNA甲基化和基因重排檢測等，DDPCR具有很高的靈敏度，可以檢測到低至0.1%的突變等位基因片段，是檢測MRD的一種較為有效的工具[12]。有研究表明，在監測BCR/ABL陽性CML患者的MRD時，相比于RT-qPCR，DDPCR可以在CML患者體內檢測到更多殘留的白血病細胞[13]。總之，DPCR是一項旨在提供絕對核酸定量的突破性技術，該技術的真正優勢可能會在未來幾年變得更加明顯。

3 基因突變檢測

白血病是一種異質性疾病，其發病涉及多種染色體異常和基因突變，這些突變影響不同功能類別的基因，并隨著時間的推移而導致疾病的發生，白血病常見的突變基因有FLT-3、CEBPA、RUNX1、DNMT3A、IDH1/2、TET2、TP53、WT1、ASXL1、MLL等。因此，高效精準的基因突變篩查方法至關重要，了解白血病的基因突變情況可以為患者的靶向治療、危險分層和臨床護理提供依據。

3.1第一代測序技術 Sanger測序法作為檢測癌癥基因突變的“金標準”，具有較高的準確性，但其檢測效率低、靈敏度低、檢測突變類型有限，且成本較高，對于沒有明確候選基因或候選基因數量較多的患者較難完成篩查。焦磷酸測序的復雜性較低，涉及的步驟更少，并且檢測極限更高，已被用于檢測一些基因的突變，例如JAK2V617F[14]，臨床上還可以用于檢測CML的耐藥性突變，如BCR-ABL1激酶結構域內的突變，這有助于為患者提供藥物反應的相關信息。

3.2下一代測序技術(NGS) 如果說Sanger測序的發展使生物學研究發生了革命性的變化，那么隨著2005年NGS方法的使用，測序技術的影響變得更加深遠。NGS是指基于一系列現代大規模平行測序(MPS)的測序技術。根據分析的復雜性和要獲得的信息，可以進行幾種測序試驗，包括全基因組測序(WGS)、轉錄組測序(RNA-SEQ)、全外顯子測序(WES)和靶向基因測序。NGS能在一次測試中對數千個基因進行全序列測定，可同時檢測缺失、插入、堿基替換、拷貝數改變和易位，包括平衡重排。NGS目前已經進入臨床實踐，用于AML診斷時的初始突變篩查，90% AML患者的分子畸變可以通過NGS來識別[15]。基于NGS的MRD分析廣泛適用于AML患者，對患者的復發率和存活率有很高的預測價值，可能有助于改進AML患者的移植和移植后管理。

單細胞測序是近幾年發展迅速的一種以NGS為基礎的測序技術，2013年曾被《Nature Methods》評為年度技術,2019年第61屆美國血液病年會報道了眾多單細胞測序技術在血液疾病中的應用，為深入了解白血病的發病機制提供了更廣闊的思路。PETTI等[16]創新性地利用基因分型聯合單細胞測序技術研究AML，揭示了AML患者體內存在不同功能子集及其相關的驅動因子。總之，NGS在過去十年里促進了醫學領域知識的爆炸性增長，雖然越來越多的研究有助于對疾病分子水平上的認識，但同時也帶來了如何將這些信息應用于日常臨床實踐的問題，必須找到一種切實可行的方法來開發利用它們。NGS將發展成為一個合適的平臺，以高通量和高準確性為優勢，提供更多分子突變數據，從而進軍標準的分子診斷領域。

3.3第三代測序技術 相比NGS，第三代測序技術在臨床上的應用有明顯優勢，第三代測序技術不需要PCR擴增，可直接對單個分子進行測序。有研究者利用單分子測序技術發現了許多Ph染色體ALL患者存在多個具有單一突變預先存在的耐藥細胞[17]。還有研究者對攜帶多個TP53突變的AML和MDS患者進行了單分子實時DNA測序技術(SMRT)，發現所有這些變異都定位在不同的亞克隆基因上，說明患者間異質性較大[18]。盡管第三代測序技術優勢很多，但并不意味著單分子測序無所不能，也并非毫無瑕疵。目前，第三代測序并不能取代NGS，而是作為對其一種補充共同發展。總體來講，第三代測序技術還處于起步的發展階段，仍有未知的空間等待進一步探索。

3.4其他方法 其他幾種檢測基因突變的方法靈敏度也比較高，比如PCR-單鏈構象多態性技術(PCR-SSCP)、低溫變性共擴增PCR技術(COLD-PCR)、高分辨率熔解曲線分析(HRM)、雙梯度變性梯度凝膠電泳(DGDGGE)、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)、變性高效液相色譜(DHPLC)等[19]。PCR-SSCP依據點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變，可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，從而達到對反應產物的檢測，常用于白血病突變基因的檢測，研究MRD的存在[20]。COLD-PCR是一種新型的PCR方法,不管突變存在于什么位置，該技術均能從野生型和含突變的序列基因混合物中選擇性擴增出為數不多的等位基因，LI等[21]最先描述了這項技術，他們用COLD-PCR取代了常規PCR后，在腫瘤標本中發現了TP53、EGFR和KRAS的突變，該方法與其他檢測方法相比靈敏度大大提高。HRM具有靈敏、經濟、快速、操作簡單的特點，能根據其變性(熔解)行為表征PCR產物，可用于檢測與真性紅細胞增多癥相關的JAK2基因第12外顯子的突變，是一種普遍適用的診斷分析方法[22]。近年來質譜技術以其微量、快速、靈敏、高精確度等優良性能而迅速發展，對于低水平的基因突變檢測，其靈敏度很高，可用于白血病的診斷、分類和監測。由美國Sequenom公司研發的MassARRAY系統現在已被廣泛應用于各種遺傳分析中，包括SNP基因分型、拷貝數變異分析、定量基因表達分析和甲基化檢測等，順應了當前基因在疾病機制研究和臨床診斷中迅猛發展的趨勢[23]。

4 小結與展望

各種分子遺傳學方法在白血病診斷中的應用比較見表1。在過去的幾年里，對白血病的研究取得了許多進步，分子診斷技術的發展促進了白血病的診斷和分型，并且已成為監測MRD的首選方式，對臨床管理具有重要意義。隨著PCR技術的日益發展，會發現更多標志性的融合基因，獲得更多的分子診斷和治療靶點。通過檢測標志性融合基因的表達，可以針對這些融合基因進行藥物個體化治療，在此之后，可以更詳細地對疾病進行分類，這樣可以有效地提高白血病的治愈率。未來的PCR技術也需要在靈敏度、特異度、測試時間和成本效益方面進一步提高，并且隨著NGS越來越多地應用于臨床研究，當前與白血病相關的基因可能會得到進一步擴展，基于NGS的基因組診斷程序將取代對單個基因突變的常規檢測。全基因組測序盡管仍然存在技術和生物信息學方面的障礙，但這項技術未來將很快應用于所有白血病的診斷。雖然一些針對白血病的分子診斷技術已經成功地應用于臨床，但是目前仍然面臨一系列挑戰，例如如何在臨床上在盡可能少的時間內以患者可承受的成本為每位患者提供更多的相關基因突變的測試。隨著分子生物學技術的發展，研究者們將會尋求到更有力的技術來幫助臨床醫生對疾病進行診斷，以便監測患者對各種治療方法的反應，并改善患者的預后。

表1 分子遺傳學方法在白血病診斷中的應用比較