陰道分泌物支原體固體和液體培養基培養結果差異及原因分析

王慶蒞，袁美晶，寧麗萍，祝仲珍，趙婉茹，郭 靚，朱皓皞，張益明，王占科

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○八醫院檢驗科，江西南昌 330002

支原體培養假陽性是造成臨床對婦科感染誤診、誤治的主要原因。支原體是介于細菌和病毒之間的微生物，呈0.1～0.3 μm絲狀或桿狀，能通過濾菌器，無細胞壁，是目前已知的能獨立生存和繁殖的細胞外最小原核細胞微生物。支原體在土壤、動物體和人體中廣泛存在，目前已發現150多種[1]。從人體分離出來的支原體有16種，解脲脲原體(Uu)、人型支原體(Mh)、肺炎支原體、生殖支原體和穿通支原體等5種支原體對人體具有致病性，其中Uu和Mh是造成女性陰道炎、宮頸炎和慢性盆腔炎的常見條件致病菌，可通過性傳播，已引起國內外學者的重視[2-3]。Uu和Mh分別具有尿素酶和精氨酸酶生化屬性，能分別分解尿素和精氨酸產生氨，使液體培養基pH值升高，導致液體培養基內的酸堿指示劑發生顏色變化(由黃色變為紅色)，可以以此原理判斷液體培養基中是否存在Uu或Mh[4]。支原體液體培養基盡管添加了抑制其他細菌生長的抗菌藥物，但由于某些細菌等非支原體微生物存在耐藥現象，支原體液體培養基并不能完全抑制非支原體微生物的生長。如果非支原體微生物也能分解尿素或精氨酸，也同樣可以使支原體液體培養基出現陽性，這是造成支原體液體培養基假陽性的主要原因[5]。支原體固體培養基培養Uu和Mh是通過觀察Uu和Mh在固體培養基上的單個菌落的特征形態來診斷Uu和Mh感染，將Uu和Mh菌落轉接到液體培養基上，可觀察Uu和Mh藥敏結果。本研究收集婦科炎癥患者陰道分泌物標本，同時進行固體培養基培養和液體培養基培養，統計兩種方法的陽性率，并分析固體培養基培養陰性但液體培養基培養陽性的原因，現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2018年1月至2019年6月在本院婦科就診的婦科炎癥患者其陰道分泌物標本354份。所有就診患者年齡18～63歲，有不同程度的陰道炎、宮頸炎、附件炎和慢性盆腔炎，并伴有白帶增多、異味和腹痛等臨床癥狀，采集陰道分泌物標本時患者最近3 d均未進行過抗菌藥物治療及性生活。

1.2儀器與試劑 陰道分泌物標本支原體固體培養基和液體培養基均由眾愛生河北生物科技有限公司生產。SW160型二氧化碳培養箱由上海皓莊儀器有限公司生產，CX31型光學顯微鏡由日本Olympus公司生產。支原體固體培養基含有促進支原體生長繁殖的營養瓊脂、蛋白胨、鹽類、小牛血清和細胞生長培養液，以及抗菌藥物等；支原體液體培養基含有小牛血清、尿素、精氨酸、酸堿指示劑及多種抗菌藥物等。細菌和真菌培養所需培養基由鄭州安圖生物科技有限公司生產。

1.3標本采集 患者清洗外陰后，用消毒后的無菌棉拭子插入陰道后穹窿處，旋轉幾周，停留10 s后取出，無菌操作條件下，迅速將含有陰道分泌物的棉拭子放置在無菌干燥試管內，及時送檢。

1.4檢測方法 陰道分泌物標本同時進行支原體固體培養和液體培養，培養方法嚴格按照液體和固體培養基試劑盒說明書進行，無菌操作下，將陰道分泌物標本接種在固體培養基和液體培養基上，放在二氧化碳培養箱中培養24～48 h。固體培養基Uu和Mh菌落形態特征通過顯微鏡觀察并記錄，液體培養基顏色變化通過肉眼觀察并記錄。支原體液體培養基培養陽性但固體培養基培養陰性的液體培養基進行細菌和真菌鑒定，以及尿素和精氨酸分解試驗，參照文獻[5]進行操作。支原體液體培養基培養陰性但固體培養基培養陽性標本再進行液體培養。

1.5結果判讀標準 支原體液體培養基由黃色變為紅色判定為陰道分泌物標本支原體培養陽性。低倍顯微鏡下觀察固體培養基菌落，菌落中有沙粒狀物質，直徑為10～50 μm較小的深褐色圓形菌落(菌落中有沙粒狀物質)為Uu；直徑為100～300 μm較大的油煎蛋狀菌落為Mh，見圖1。如果固體培養基上出現一種菌落代表接種標本中存在一種支原體感染。如果固體培養基上同時出現兩種支原體菌落，說明標本中同時存在Uu和Mh感染。

圖1 支原體固體培養基Uu和Mh菌落形態

1.6統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計學分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1支原體固體培養基培養結果 354份陰道分泌物標本中固體培養基培養陽性(Uu或Mh陽性)標本為112份，其中單純Uu陽性86份，陽性率為24.29%；單純Mh陽性9份，陽性率為2.54%；Uu合并Mh陽性17份，陽性率為4.80%。Uu或Mh陽性率(31.64%)明顯高于單純Mh陽性率及Uu合并Mh陽性率，差異均有統計學意義(χ2=105.75、85.55，P<0.001)； 單純Uu陽性率與單純Mh陽性率進行比較，差異有統計學意義(χ2=72.08，P<0.001)； 單純Uu陽性率與Uu合并Mh陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=54.09，P<0.001)。

2.2支原體液體培養基和固體培養基培養陽性率比較 354份陰道分泌物標本中液體培養基培養陽性標本為145份，培養陽性率為40.96%；固體培養基培養陽性標本112份，培養陽性率為31.64%。液體培養基培養陽性率明顯高于固體培養基培養陽性率，差異有統計學意義(χ2=6.65，P<0.001)。

2.3支原體液體培養基和固體培養基培養結果不一致性分析 145份液體培養基培養陽性標本中，35份固體培養基培養陰性，兩種培養方法陽性結果不一致率為24.14%。209份液體培養基培養陰性標本中，2份固體培養基培養陽性，兩種方法陰性結果不一致率為0.96%。見表1。

表1 354份陰道分泌物標本支原體液體培養基和固體培養基培養情況(n)

2.4支原體液體培養基培養陽性但固體培養基培養陰性標本細菌和真菌鑒定結果 35份支原體液體培養基培養陽性但固體培養基培養陰性標本，將液體培養基轉接到細菌和真菌培養基上進行再次培養和鑒定，分離出大腸埃希菌17株，變形桿菌13株，表皮葡萄球菌11株，陰溝腸桿菌4株，新型隱球菌2株，進一步做尿素和精氨酸分解試驗，分離出來的細菌和真菌均能分解尿素或精氨酸產生氨。

2.5支原體液體培養基培養陰性但固體培養基培養陽性標本再進行液體培養情況 2份支原體液體培養基培養陰性但固體培養基培養陽性標本，盡管固體培養基陽性，但菌落數均不超過2個，將固體培養基上的單個菌落轉接到支原體液體培養基中進行再培養，結果均陽性。

3 討 論

支原體革蘭染色不易著色，姬姆薩染色呈淡紫色，可通過二分裂或出芽方式繁殖，繁殖速度比細菌慢，適宜生長溫度為35 ℃，最適pH值為7.8～8.0。Uu和Mh一般不進入血液，可存在于女性生殖道黏膜內，通過黏附宿主細胞，獲取脂質和膽固醇，使宿主細胞膜損傷，造成局部炎性反應[6]，Uu和Mh作為人體寄生的常見支原體，是導致婦科炎癥的主要病原微生物[7-8]。陰道分泌物是檢驗科微生物實驗室常見標本，提高體外培養鑒定陰道分泌物標本Uu和Mh的準確性是微生物檢驗醫學的重要內容，支原體培養結果出現假陽性或假陰性，不僅不能指導臨床科室診斷和治療支原體感染，還可能對婦科患者造成誤診或漏診。

支原體培養包括固體培養基培養和液體培養基培養[9]，固體培養基培養能通過Uu和Mh的菌落特征準確判斷是哪種支原體陽性，液體培養基培養不僅可以培養支原體還可以做藥敏試驗，不足之處在于液體培養基培養根據Uu和Mh能分解尿素和精氨酸，產生氨，使液體培養基酸堿指示劑變成紅色來推測支原體的存在，因而并不能準確區分Uu和Mh陽性，而且任何分解液體培養基中尿素或精氨酸的微生物均可以使液體培養基培養結果呈陽性，導致液體培養基出現假陽性[10]。

支原體固體培養基培養通過菌落形態特征可區分患者陰道分泌物標本是單純Uu感染、單純Mh感染，還是Uu合并Mh感染。本研究結果發現，婦科炎癥患者單純Uu陽性率明顯高于單純Mh陽性率，提示Uu是導致婦科炎癥的主要支原體類型。Uu合并Mh陽性率高于單純Mh陽性率，提示Uu合并Mh感染應引起臨床重視。為比較陰道分泌物標本支原體液體培養基和固體培養基陽性率，354份標本同時做固體培養基和液體培養基培養結果發現，二者培養結果不一致，液體培養基培養陽性率(40.96%)明顯高于固體培養基(31.64%)。如果支原體液體培養基培養為假陽性，會造成臨床科室對婦科炎癥患者支原體感染的誤診，臨床醫生按照支原體感染對患者進行治療，不僅可能無效，而且還會給患者帶來不必要的經濟負擔和心理壓力。

為探討支原體液體培養基和固體培養基培養結果不一致的原因，本研究對35份固體培養基培養陰性但液體培養基培養陽性標本的液體培養基轉接進行細菌和真菌鑒定分析，結果發現液體培養基含有能分解尿素或精氨酸的細菌或真菌，主要為大腸埃希菌、變形桿菌、表皮葡萄球菌、陰溝腸桿菌和新型隱球菌，這和文獻[10-11]的報道基本一致。陰道分泌物標本含有分解尿素和精氨酸的細菌或真菌，是導致支原體液體培養基培養結果假陽性的主要原因，其藥敏結果并不是支原體感染的藥敏結果，對臨床支原體感染診斷和治療無臨床價值。本研究結果還發現，有2份陰道分泌物標本固體培養基培養陽性但液體培養基培養陰性，這種情況比較少見，可能與標本內支原體數量太少導致液體培養基氨生成量不夠，顏色變化不明顯有關。

固體培養基一個支原體菌落代表一個支原體繁殖出來的聚集體。本研究將2份支原體液體培養基培養陰性但固體培養基培養陽性的菌落轉接到液體培養基進行再培養，液體培養基均為陽性結果，提示液體培養基培養陰性但固體培養基培養陽性，并不是固體培養基支原體假陽性，而是液體培養基培養假陰性，提示支原體固體培養基靈敏度可能高于液體培養基靈敏度。支原體固體培養基培養得到陽性結果后，然后再把固體培養基上的支原體菌落轉接到液體培養基做藥敏試驗，是降低液體培養基假陽性結果發生率的重要措施，值得進一步探討。患者的陰道分泌物含有大量的細菌和真菌，如何避免標本內細菌或真菌對支原體液體培養結果的干擾，值得進一步研究。