鉬靶聯合hMAM、BRCA-1表達水平檢測對乳腺癌的診斷價值

溫冰馨，王 斌

中一東北國際醫院普外科一科，遼寧沈陽 110021

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率及致死率在全球逐年升高，成為女性發病率最高的腫瘤，在女性惡性腫瘤致死率中高居第六位，成為危害女性健康的第一大殺手[1]。早期診斷乳腺癌具有重要的臨床意義。目前，診斷乳腺癌的方法主要為影像學檢查，如超聲、鉬靶檢測等，但是對于早期患者的篩選準確率仍有待提高[2-3]。乳腺癌在分子生物學上具有較為特異的表征，如乳腺癌人乳腺珠蛋白(hMAM)基因、乳腺癌易感基因-1(BRCA-1)等，可作為預測乳腺癌發生的高危風險因子[4-5]。本研究分析了鉬靶及hMAM、BRCA-1表達水平檢測對乳腺癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年8月在本院就診的乳腺癌患者150例納入腫瘤組，年齡(41.12±4.74)歲；病理類型包括浸潤性導管癌88例，原位癌22例，腺癌26例，浸潤性小葉癌14例。另選取同期就診的良性乳腺腫瘤患者100例納入良性組，年齡(42.09±5.10)歲；病理類型包括乳腺纖維腺瘤78例，乳腺囊性增生病16例，乳管內乳頭狀瘤6例。兩組患者年齡比較，差異無統計學意義(t=1.537，P=0.125)。腫瘤組納入標準：經病理診斷符合乳腺癌診斷標準[6]的患者；首次診治患者。腫瘤組排除標準：合并其他類型惡性腫瘤患者；復發轉移患者；合并嚴重肝、腎、心腦血管等疾病患者；孕婦或哺乳期女性。良性組納入標準：經病理診斷符合良性乳腺腫瘤診斷標準[7]的患者；首次診治患者。良性組排除標準：合并嚴重肝、腎、心腦血管疾病患者；孕婦或哺乳期女性。本研究經過本院醫學倫理委員會審閱同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法 兩組患者均行鉬靶及hMAM、BRCA-1檢測，比較兩組患者相關參數差異，繪制ROC曲線分析各指標單獨及聯合檢測的診斷價值。(1)鉬靶檢測：患者取平臥位，進行X射線掃描，對兩側乳房及周圍組織顯影；陽性的診斷標準為患者腫塊顯影清晰，與周圍組織界限不清，鈣化點較為清晰，否則為陰性。每例患者由兩位具有5年以上鉬靶檢測診斷乳腺癌工作經驗的醫師獨立完成，意見不一致時討論得出一致結果。(2)實驗室指標檢測：①提取總RNA。取患者靜脈血5 mL，棄去開始的1 mL防止其他細胞污染，取1 mg/mL血液標本采用乙二胺四乙酸(EDTA) 抗凝，生理鹽水稀釋2～3倍，人淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取總 RNA。②cDNA合成。設計甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，并制備反轉錄反應體系20 μL(總RNA 1 μL+隨機引物200 ng+ RNasin 20 U+5×反轉錄反應緩沖液 4 μL+M-MLV 反轉錄酶20 U，加無檢酸酶的水補充體積至20 μL)，42 ℃反應55 min。③PCR擴增。hMAM以GAPDH為內對照，BRCA-1以β-微球蛋白為內對照，取反轉錄反應產物2 μL，0.2 μL的三磷酸脫氧核苷(dNTP，10 nmol/L)，0.15 μL 牛血清清蛋白(BSA，10 μg/μL)，0.5 μL引物(10 μg/L)，MgCl21 μL(25 mmol/L)，0.1 μg DNA聚合酶，1 μL水解探針(3 μg/L)，焦碳酸二乙酯(DEPC)-水(H2O)(加至10 μL)。條件為95 ℃ 3.5 min，95 ℃ 10 s；退火55 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，45個循環。根據標準曲線，7500 Fast Sequence Detector分析儀自動計算出標本中hMAM、 BRCA-1與GAPDH、β-微球蛋白的表達水平，并計算hMAM、BRCA-1與GAPDH的比值。反應中所涉及的反轉錄反應體系、PCR反應體系及7500 Fast Sequence Detector分析儀為美國ABI公司生產。引物設計及合成采用 PE公司Primer Express軟件設計引物和探針，引物由上海基康生物技術有限公司合成。診斷標準：hMAM及BRCA-1表達水平在受試者工作特征(ROC)曲線cut-off值上方即為陽性，下方為陰性。

2 結 果

2.1兩組鉬靶檢測結果比較 腫瘤組鉬靶檢測陽性率為68.7%(103/150)，良性組為27.0%(27/100)，差異有統計學意義(χ2=41.730，P<0.05)。

2.2兩組hMAM、BRCA-1表達水平比較 腫瘤組hMAM表達水平明顯高于良性組，差異有統計學意義(t=49.723，P<0.05)，腫瘤組BRCA-1表達水平明顯低于良性組，差異有統計學意義(t=30.632，P<0.05)。見表1。

表1 兩組各項實驗室指標表達水平比較

2.3鉬靶、hMAM及BRCA-1表達水平單獨和聯合檢測的診斷性能 以鉬靶檢測及hMAM、BRCA-1表達水平作為檢驗變量，是否診斷為乳腺癌為狀態標量，以1—特異度為X軸，以靈敏度為Y軸繪制ROC曲線，見圖1。根據ROC曲線可得，聯合檢測的靈敏度明顯高于各指標單獨檢測，且聯合檢測的AUC明顯高于各項指標單獨檢測，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 單獨及聯合檢測對乳腺癌的診斷性能比較

圖1 ROC曲線分析

3 討 論

以往研究表明，乳腺癌早期診斷能明顯改善患者生存率[8]，但目前臨床缺乏其早期篩查的有效手段，因此，探索簡單、有效、非侵入性的早期乳腺癌檢查方法具有重要的臨床意義。影像學檢查，如鉬靶檢測在乳腺占位性病變的檢查中有獨特的優勢，操作簡便，重復性強[9]。同時，乳腺癌在分子表型上具有特異性表征，約40%的乳腺癌患者存在hMAM及BRCA-1過度表達，因此，進行乳腺癌相關基因的表達檢測也可為其診斷提供重要的依據[10]。

鉬靶檢測是乳腺癌診斷的常用方法，通過放射性顯影觀察病灶形態、大小、部位、與周圍組織關系、邊緣、鈣化等特征，以此判斷病灶的良惡性，具有操作簡便、重復性好等特點[11]。含笑等[12]的研究表明，簇狀鈣化、腫塊及兩者合并是乳腺癌鉬靶檢測結果的3個重要特征。本研究中，鉬靶檢測診斷乳腺癌的靈敏度為68.7%，特異度為73.0%，AUC為0.792。陽君[13]的研究表明鉬靶檢測診斷乳腺癌的準確率為72%，結果與本研究接近。但進一步分析發現，鉬靶檢測在篩選具有一定典型病灶形態的乳腺癌中具有優勢，但是對于一些存在非特異變化的良性病變可能會產生誤診，而對于小病灶、不典型的病灶可能會造成漏診，需要聯合其他指標提高診斷效能。

hMAM是乳腺癌相關基因，在人體第11號染色體上，正常情況下在成人的乳腺組織表達，而在乳腺癌細胞中可過度表達，因此，臨床可依據其表達水平進行乳腺癌的診斷[14]。BRCA-1在人體第17號染色體上，正常情況下作為一種抑癌基因參與細胞周期調控、細胞增殖及損傷修復等過程，突變后可見表達水平降低或缺失，與乳腺癌、卵巢癌的發生密切相關[15]。本研究中，hMAM表達水平診斷乳腺癌的cut-off值為6.32×105copy/mL靈敏度為57.3%，特異度為82.0%，AUC為0.753(95%CI:0.697～0.809)；BRCA-1表達水平診斷乳腺癌的cut-off值為0.55×105copy/mL，其對應的靈敏度為60.7%，特異度為61.0%，AUC為0.642(95%CI:0.572～0.711)。hMAM、BRCA-1表達水平診斷乳腺癌是針對發生了相關基因突變的乳腺癌的診斷，但這些只是乳腺癌中的一部分，會產生漏診；因此，hMAM、BRCA-1表達水平診斷乳腺癌的靈敏度較低，單獨診斷價值有限。

既往研究表明，聯合多種方法診斷乳腺癌可提高其檢出率[16]。本研究中鉬靶、hMAM、BRCA-1聯合診斷乳腺癌的靈敏度(78.7%)明顯高于單項檢測的靈敏度(68.7%、57.3%、60.7%)，差異有統計學意義(P<0.05)；聯合檢測在提高乳腺癌檢測靈敏度的同時，還保持了較高的特異度(79.0%)，聯合檢測的AUC明顯高于單獨檢測，表明聯合檢測可提高乳腺癌的檢出率，具有較好的臨床應用前景。結合前文，鉬靶檢測診斷乳腺癌靈敏度較低，特異度較高，存在漏診的情況；而hMAM、BRCA-1表達水平診斷靈敏度低，診斷性能有限，因此，將三者聯合可提高乳腺癌的診斷靈敏度，同時保持較高的特異度，明顯提高了診斷性能。