精索靜脈曲張不育患者各項精液分析指標的特征及其臨床價值*

王希部，羅燕萍，劉麗亞，莫紅梅

廣東省深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518000

精索靜脈曲張臨床定義為精索臍帶狀叢中靜脈異常擴張和彎曲，是男性不育的常見原因之一。有研究表明，近40%的男性不育由精索靜脈曲張導致[1]。精索靜脈曲張的發生機制由多因素導致，其中氧化應激為核心機制。精子的DNA和脂質膜直接受到活性氧族(ROS)的攻擊，導致精子DNA損傷，引起精子DNA碎片增加。因此，精子DNA完整性檢測是反映精子DNA損傷程度的一項重要指標，精子DNA損傷可以使男性不育。另外，氧化應激可影響精子核酸結構和功能，致使精子蛋白氧化，損傷睪丸，同時，通過氧化細胞膜誘發生精細胞凋亡，從而導致精子形態、運動性和受精能力的改變。本研究擬通過分析精索靜脈曲張不育患者和健康婚育檢查人士精子DNA完整性和精液常規參數分析指標之間的關系，用多參數聯合檢測旨在為精索靜脈曲張患者不育中的篩查和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選擇本院2019年確診的107例精索靜脈曲張，并同時檢查精子DNA完整性和精液常規參數、精子形態的不育患者納入精索靜脈曲張組。精索靜脈曲張以B超診斷為金標準，其中1級精索靜脈曲張82例，2級精索靜脈曲張15例，3級精索靜脈曲張10例；平均年齡為(32.0±6.1)歲。再選擇同期健康婚育檢查人士60例作為健康對照組，平均年齡為(33.5±6.9)歲。兩組間年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 儀器：上海北昂BEION S3精液分析儀與配套計數池，邁瑞BriCyte E6流式細胞儀。試劑：貝索精子形態學快速染色液，包括固定劑(Diff-Quick Fix)、染液Ⅰ(Diff-Quick Ⅰ)、染液Ⅱ(Diff-Quick Ⅱ)；浙江星博生物科技股份有限公司精子DNA完整性檢測試劑盒，醫療器械注冊證號為浙甬食藥監械(準)字2012第1400127號，試劑規格為10人份/盒，試劑由A、B、C1和C2液4部分組成。

1.3方法

1.3.1精液標本的采集及處理 所有研究對象禁欲3～7 d，手淫法取出精液放置于無菌杯中，并記錄取精時間和禁欲天數，立即送檢。收到標本置于37 ℃水浴箱中孵育，待精液完全液化，利用計算機輔助精子分析系統進行各項精液常規參數分析，使用“拉薄”技術進行精子形態學分析，留取0.5 mL精液用于精子DNA完整性分析。若精子DNA完整性不能及時檢測，放置于—20 ℃冰箱進行保存，1周內進行檢測。

1.3.2精液常規參數分析 使用上海北昂BEION S3精液分析儀及配套計數池，按照儀器標準操作規程，待標本完全液化后混勻，吸取液化精液5 μL，沖池放入計數池，樣品自行擴散充滿倉室內部，再靜置1 min進行檢測，通過顯微圖像采集系統將精子圖像放大,并將結果輸入計算機，同時顯示在屏幕上，在計算機軟件控制下，全自動顯微鏡自動掃描顯微鏡下的精子圖像，并記錄精子的運動軌跡，通過軟件分析，計算標本的精子濃度、存活率及活力級別、前向活動力精子(PR)等各項參數。

1.3.3精子形態學分析 嚴格按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》，取液化后混勻的精液(5～10 μL)，使用“拉薄”技術，制成適當厚度涂片，待自然干燥后第2天，使用貝索精子形態學快速染色液(Diff-Quick法)，按照說明書對精子進行染色，油鏡計數200個精子，記錄正常精子數、頭部缺陷精子數、中段缺陷精子數、尾部缺陷精子數，由此計算出正常精子百分比(PNS)、畸形精子指數(TZI)、精子畸形指數(SDI)。

1.3.4精子DNA完整性檢測 正常精子DNA緊密結合，且具有抗酸性，維持雙鏈的穩定性，而受損的或不成熟的精子形成松散的染色質結構，其DNA在酸作用下變成單鏈，吖啶橙(AO)與雙鏈DNA結合發出綠色熒光，與單鏈DNA結合發出紅色熒光。采用精子染色質結構分析法，使用浙江星博生物科技股份有限公司精子DNA完整性檢測試劑盒進行檢測，嚴格按照說明書操作，每管按計算取樣量加入精子標本，再加入A液至100 μL，冰上充分混勻，加入B液 200 μL，準確計時30 s，再加入染色液(C1+C2液配制而成)600 μL，冰上靜置1 min后立即使用邁瑞流式細胞儀進行檢測，流式檢測速度大約為每秒200～300個，以收集5 000個粒子數為結束條件。將流式細胞儀檢測完畢的文件導出，采用專用軟件進行處理，計數得出精子DNA碎片指數(DFI)和高DNA可染性(HDS)。

2 結 果

2.1兩組各項精液分析指標結果比較 精索靜脈曲張組和健康對照組各項精液分析指標比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組各項精液分析指標結果比較

2.2精子DFI與其他精液分析指標的相關性分析 精子DFI與HDS、TZI、SDI呈正相關(r=0.530、0.454、0.306，P<0.05)，與PR、PNS呈負相關(r=—0.559、—0.245，P<0.05)，與精子濃度無明顯相關性(r=—0.112，P>0.05)。

2.3多因素Logistic回歸分析 精子DFI、HDS是精索靜脈曲張不育的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析

2.4各項精液分析指標和聯合檢測對精索靜脈曲張不育的診斷價值 聯合檢測的診斷效果明顯優于單獨檢測。單獨檢測中，以精子DFI診斷效能最佳。見表3、圖1。

圖1 各項指標聯合檢測與單獨檢測診斷精索靜脈曲張不育的ROC曲線

表3 各項精液分析指標及聯合檢測對精索靜脈曲張不育的診斷價值

3 討 論

精索靜脈曲張是影響生育能力的重要因素之一，其導致男性不育的機制仍未完全闡明。精索靜脈曲張導致男性不育的因素有氧化應激、精子DNA損傷、睪丸缺氧、局部高溫、腎臟及腎上腺代謝物質的反流、一氧化氮、免疫因素等，其中氧化應激是臨床公認的一個關鍵重要機制，此學說通過分子機制闡述了精索靜脈曲張會引起精液質量的下降和精子DNA的損傷。而精子DNA的損傷又會負反饋地促進更多的ROS產生，引起惡性循環[2]。本研究結果顯示，與健康婚育檢查人士相比，精索靜脈曲張不育患者的精子濃度、PR、PNS均降低，而精子DFI、HDS、TZI、SDI均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究結果與鐘慧芝等[3]的研究一致，這說明精索靜脈曲張不育患者生成的精液質量較差，生育能力下降，也印證了氧化應激的分子機制學說。

精子遺傳信息的載體主要是頭部的DNA和中部線粒體DNA。精子DNA的損傷主要由細胞凋亡、ROS的影響、染色質的異常所導致[4]。劉利敏等[5]研究發現，ROS結果與精子DFI呈正相關，ROS的增加會導致氧化應激的發生。有研究表明，氧化應激是導致精索靜脈曲張發生的因素之一[6]。本研究通過多因素Logistic回歸分析顯示，精子DFI和HDS是精索靜脈曲張不育的獨立危險因素。這說明精子DNA完整性與精索靜脈曲張具有密切的關系，精索靜脈曲張會損傷精子DNA，引起精子染色質異常。通過篩查精子DNA完整性，可以對男性的生育能力進行評估，同時進一步印證了上面的分子機制學說。

精子DNA完整性的檢測在生殖醫學中極其重要，關于精子DFI與精液常規參數分析、精子形態學分析的各指標相關性已有較多報道，但關于聯合相關參數在精索靜脈曲張不育患者中的診斷效能的研究相對較少。本研究結果顯示，精子DFI與HDS、TZI、SDI呈正相關(r=0.530、0.454、0.306，P<0.05)，與PR、PNS呈負相關(r=—0.559、—0.245，P<0.05)，與精子濃度無明顯相關性(r=—0.112，P>0.05)。除精子濃度外，與曾蘭等[7]研究結果一致，而精子濃度結果與李非凡等[8]研究結果一致。精子DFI、HDS、PR、精子濃度、PNS、TZI、SDI多參數聯合檢測診斷精索靜脈曲張不育的AUC為0.871(95%CI：0.819～0.924，P<0.05)，靈敏度為71.0%，特異度為95.0%，陽性預測值為95.0%，陰性預測值為65.5%，約登指數為0.660，診斷效能最高。聯合檢測的特異度高達95.0%，與B超診斷的特異度基本一致[9]。提示聯合檢測優于單獨檢測的診斷效能。單個項目中，精子DFI和HDS診斷精索靜脈曲張不育患者效能較高，其次為TZI和SDI，其他參數診斷效能較低，不能用于男性生育能力的評估和判斷患者預后，這與COCUZZA等[10]研究一致，說明精子DNA完整性與精索靜脈曲張不育關系密切。

精子DNA完整性與精液常規參數分析項目具有關聯性，可以作為精索靜脈曲張不育的臨床篩查指標，而精子DNA完整性聯合精液常規參數分析能夠為精索靜脈曲張不育提供更為準確的診斷，可以更好地為臨床提供幫助，建議將聯合檢測作為常規檢測。