基于轉錄組測序技術研究慢性避水應激對大鼠腰膨大脊髓背角中基因表達的影響

馬力天,白 楊,林 強,蘇保偉,孟憲博,王景杰*

(1空軍軍醫大學第二附屬醫院消化內科,西安 710038;2解放軍北部戰區總醫院神經外科;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

慢性應激在功能性胃腸病癥狀的發生和發展中起重要作用。慢性避水應激模型(chronic water avoidance stress,CWAS)是Sylvie Bradesi教授在2005年首次提出,該模型會出現持久的內臟痛覺敏化(不低于1個月)、焦慮樣行為、糞便顆粒數增多以及結腸免疫系統的輕度激活[1]。腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種慢性的功能性胃腸病。全球有9%-23%的人常被該病困擾,并尋求醫治[2]。IBS的發生發展與慢性、持續、緊張的人類日常精神應激事件息息相關,且文獻表明IBS患者也伴有輕度焦慮和抑郁[3,4]。這些特征與CWAS符合得很好,因此,該模型常被用于研究IBS的內臟痛覺敏化和腸道動力異常。本研究通過慢性避水應激法建立大鼠的CWAS模型,并利用OFT和AWR分別評價其焦慮樣行為和內臟敏感性,之后采用轉錄組學測序探究其腰膨大處脊髓背角中基因表達的變化,為后續對慢性應激的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、主要儀器和試劑

SPF級健康雄性SD大鼠24只,體質量180-220 g,由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。大鼠在實驗前進行為期1周的適應性飼養,環境溫度22-26 ℃,濕度40%-60%,自由飲食,光照12 h/12 h明暗交替。所有的努力都是為了減少實驗動物的數量和痛苦。過量使用2%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)安樂死動物后進行取材。本研究實驗動物的使用及處置方法符合3R原則,實驗開展前經過空軍軍醫大學動物倫理委員會的批準。24只大鼠被隨機分成兩組:假模型組(sham組)和慢性避水應激組(CWAS組),每組12只。

高通量轉錄組測序儀(Illumina),Qubit熒光計(Invitrogen,Q32866),微型旋渦混合儀(上海滬西,WH-3),臺式高速低溫離心機(Thermo,Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R),PCR儀(Bio-rad,T100TMThermal Cycler),電泳儀(北京六一,DYY-11),生物電泳圖像分析系統(復日,FR-980A)。

Qubit RNA檢測試劑盒(Life,Q32855),Qubit DNA檢測試劑盒(Life,Q10212),Hieff NGSTMMaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina(YEASEN,12301ES96),Hieff NGS DNA Selection Beads(YEASEN,12601ES96)。

1.2 CWAS造模方法

根據文獻[5]所述,用亞克力板制作一透明塑料盒,長寬高分別為45,25,25 cm。其中央有一平臺,長寬高分別為10,8,8 cm(見圖1)。實驗時,向盒中注入25 ℃的水,水面距臺面約1 cm。每日上午9點將大鼠輕輕放置于平臺上1 h,并持續10 d。對照組放置于不盛水的相同的塑料盒中,時間與CWAS相同。

圖1 自制的CWAS造模設備

1.3 曠場實驗

曠場實驗(open field test,OFT)由黑色有機玻璃組成,長寬高分別為100,100,60 cm,中間50 cm×50 cm為中央區。提前24 h將大鼠飼養于行為室。實驗時,雙手輕輕將大鼠抱起置于中央區,使用動物追蹤系統(Shanghai Mobile Datum Information Technology)記錄大鼠活動軌跡10 min。每只動物檢測前,清理其中大小便并用70%的乙醇擦拭實驗裝置,待酒精完全揮發后進行下一次實驗。采用中央區路程百分比、中央區活動時間百分比來評價大鼠焦慮行為。

1.4 腹壁撤退反射

腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)是公認的評價內臟敏感性的方法。AWR通過擴張腸道,觀察動物腹部收縮的程度來評價動物內臟敏感性。利用血壓計、橡膠手套(中指段)、三通管和8F導尿管(沃德硅膠管)自制實驗設備(見圖2)。實驗前用乙醚輕微麻醉大鼠,并提前30 min將其置于亞克力材質的自制有機玻璃盒中,使大鼠無法前后運動。氣囊每次進入大鼠肛門的深度約為6 cm,并用膠布將尿管末端黏在大鼠尾根部,防止脫落。同一壓力擴張時間約為20 s,每次擴張的間隔時間為4 min。分別在20,40,60,80 mmHg四個壓力等級處觀察大鼠行為學反應,并按照以下標準進行評分[6]:0分,大鼠對擴張無任何反應;1分,大鼠出現輕微不適,偶爾扭動頭部;2分,腹背部肌肉輕微收縮但未抬離地面;3分,肌肉強烈收縮并將腹部抬離地面;4分,呈弓形,并將腹部和會陰部抬離地面。每一壓力等級測量3次取平均值進行統計學分析。

圖2 自制的AWR測量儀器

1.5 真核轉錄組RNA建庫、測序和分析

分別選取對照組和CWAS組各3只大鼠,安樂死后用脊髓吹出法[7]取出脊髓,并使用無RNA酶的手術器械小心取出腰膨大處的脊髓背角,置于凍存管內并于液氮中速凍。首先利用Qubit RNA檢測試劑盒對總RNA精確定量并進行mRNA純化和片段化。之后合成、純化雙鏈cDNA、末端修復/dA尾添加反應、接頭連接,并進行分選,用于文庫擴增。最后用凝膠電泳進行文庫質檢,并進行測序,測序后依次進行樣本質量控制、樣本相關性檢驗、表達差異分析及差異基因功能富集分析,具體步驟如下。

①樣本質量控制:高通量測序平臺(Illumina HiseqTM)測得的原始圖像數據文件經CASAVA軟件堿基識別(base calling)分析轉化為原始測序序列(sequenced reads),稱為raw reads。raw reads中含有帶接頭的、低質量的序列。為了保證信息分析質量,必須對原始數據過濾,得到過濾后的數據,使用數據過濾軟件(Trimmomatic)進行數據處理。

②樣本相關性檢驗:在本實驗中,每組有3個生物學重復,其目的一方面證明涉及的生物學實驗操作是可以重復的且變異不大,另一方面確保后續得到可靠的結果。在轉錄組學測序結果的分析中,為了使不同基因、不同實驗之間的基因表達水平具有可比性,TPM(transcript per million)被引入用來估算基因表達水平。TPM同時考慮了測序深度、基因長度以及樣本對reads計數的影響,常用于基因表達水平的估算。樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。采用Pearson相關系數表示樣本間基因表達的相關性,Pearson相關系數數越接近于1,表明相關性越強[8]。

③表達差異分析:對照組和CWAS組,每組有3個生物學重復,我們采用R中的軟件包DESeq進行分析。篩選條件設為:q<0.05(q值是校正后的P值,該值越小表示基因表達差異越顯著)且差異倍數|fold change|>2。

④差異基因功能富集分析:與基于基因表達差異分析不同,基因富集分析可以找出表達水平有差異的基因集。富集分析為基因集合的表達差異分析,能夠識別出生物現象最相關的生物學途徑。使用ClusterProfiler進行功能富集分析,當q(校正后的P值)小于0.05時,認為該功能存在顯著富集情況。我們采用GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)兩種分析方法對差異基因進行功能注釋,并繪制差異基因富集功能氣泡圖。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 CWAS組大鼠的行為學變化

OFT結果提示,與對照組相比,CWAS組的中央區路程百分比和中央區活動時間百分比均顯著低于對照組(P<0.01,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 CWAS組大鼠的內臟敏感性增加

造模結束后,與對照組相比,CWAS組在20,40,60,80 mmHg壓力下的AWR評分顯著增加(P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,*P<0.05

2.3 各樣本質量控制后數據信息

使用數據過濾軟件(Trimmomatic)依次去除帶N堿基的序列、去除reads中的接頭序列和去除低質堿基。各樣本質量控制后數據信息見表1。

表1 各樣本質量控制后數據信息

2.4 樣本相關性檢驗結果

對不同樣品的基因表達圖譜進行相關性分析,并制作成熱圖(見圖5),結果表明,生物學重復樣本間相關性較好,能夠進行下一步統計學分析。

顏色塊代表相關性指數值,顏色越灰表示樣本間相關性指數越低,顏色越黃則相關性指數越高

2.5 組間基因表達差異分析

與對照組相比,CWAS組有11個基因發生了上調,基因表達差異分析結果見表2。我們選用散點圖將基因在兩組中測量值用點表示在坐標系中,可以直觀地反映出兩個測量值之間的關系,結果見圖6。散點圖中,橫縱軸分別為兩組樣本log2TPM值,圖中每個點代表一個基因,越接近原點的點表達量越低。其中紅色表示上調基因,綠色表示下調基因,黑色表示非差異基因,上調/下調均是縱軸樣本相對于橫軸樣本。

表2 CWAS組中發生上調的基因

圖6 兩組間差異基因表達散點圖

2.6 差異基因功能富集分析

通過GO富集分析和KEGG富集分析,可以識別出生物現象最相關的生物學途徑。氣泡圖的縱軸表示功能注釋信息,橫軸表示功能對應的富集指數(注釋到該功能的差異基因數目除以注釋到該功能的基因數目),q(校正后的P值)的大小用點的顏色表示,q越小則顏色越接近紅色。每個功能下包含的差異基因的多少用點的大小來表示。CWAS組與對照組相比,細胞質部分的差異最大(校正后P<0.05,見圖7);CWAS組的PI3K-Akt、FoxO、NF-κB和破骨細胞分化相關信號通路被激活(見圖8)。

圖7 兩組間差異基因的GO富集分析

圖8 兩組間差異基因通路的KEGG富集分析

3 討論

一些與壓力相關的精神類疾病或者應激常會導致內臟痛,并常合并焦慮癥和抑郁癥,然而其具體機制仍有待闡明[9]。在嚙齒類動物中,束縛應激、避水應激和母嬰分離常被用于研究應激引起的內臟敏化,有證據表明,長期的應激會促進對疼痛的感知并使疼痛感覺通路更加敏感[10]。既往的研究表明,應激誘導的內臟痛與大腦內DNA甲基化和組蛋白乙酰化模式改變有關,從而導致傷害感受神經遞質表達增加[11]。然而,脊髓中內臟痛覺敏化的機制需要進一步研究。在本研究中,我們用轉錄組學測序分析了CWAS組與對照組之間脊髓背角腰膨大中基因表達的差異,并進行了富集分析。結果提示,與對照組相比,CWAS組有11個基因表達顯著上調,以下將分別進行討論。

Retsat主要編碼視黃醇飽和酶,該酶催化全反式視黃醇雙鍵的飽和,導致生成二氫類視黃醇代謝物。除了主要參與維生素A的代謝之外,還可以調節細胞對氧化應激的反應,是細胞對氧化應激和活性氧(ROS)的主要調節劑,并在脂肪的形成和積累中發揮重要作用[12]。慢性不可預測的輕度應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)會產生氧化應激和炎癥相關的代謝改變,并最終引發許多慢性退行性疾病,例如心血管疾病、糖尿病和阿爾茲海默病[13]。慢性避水應激會引起小鼠神經系統炎癥[14]以及大鼠腸道黏膜炎癥[15]。Retsat在CWAS組中的上調,可能是對CUMS響應。

Sgk1基因編碼血清和糖皮質激素調節蛋白激酶,是一種新的絲/蘇氨酸蛋白激酶,該酶在細胞應激反應中起重要作用。當細胞受到糖皮質激素、血清、IL-6、扭轉力刺激等,Sgk的轉錄水平會迅速升高[16]。升高的SGK1調節下游多個信號通路,抑制細胞凋亡,拮抗缺血再灌注所致的神經細胞凋亡。此外,SGK1在抑郁癥患者和動物體內的表達水平明顯升高,可能與抑郁癥的發生有關[17,18]。SGK1與CWAS的直接聯系尚未有報道,我們推測,SGK1可能與慢性避水應激引起的大鼠的焦慮情緒有關,可能也參與了CWAS引起的炎癥反應,這需要進一步驗證。

ZBTB16亦稱為早幼粒細胞白血病鋅指蛋白(PLZF),該蛋白除了調控細胞周期并參與細胞增殖、凋亡等過程外,還可被糖皮質激素強烈誘導,引起脂質和胰島素水平的改變[19,20],并通過降低正常小鼠IRS1、Akt和FoxO1磷酸化來負調節胰島素信號通路[21]。下丘腦—垂體—腎上腺軸(HPA)的持續激活是慢性應激的顯著特征之一[22],激活的HPA釋放皮質醇,激活多種信號通路,并啟動基因組事件,從而導致外周和中樞神經系統生理發生長期變化[23]。慢性避水應激可能是通過激活HPA軸產生皮質醇,并誘導ZBTB16的表達增加,參與了CWAS所致的內臟敏化,并與神經可塑性有關。

CDKN1A(Cyclin dependent kinase inhibitor 1A)編碼一種細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑,是調控細胞周期的一個重要因子。P53嚴格調控該基因的表達,通過該蛋白介導P53依賴細胞周期G1期停滯,以響應各種應激刺激。該基因還可在S期DNA復制和DNA損傷修復中起調節作用。流行病學研究表明,慢性心理應激會促進腫瘤發生,其可能的原因是慢性應激激活HPA軸并釋放皮質醇,誘導ZBTB16和SKG1的表達增加,進而增加MDM2并降低P53的活性與功能[24]。P53功能的降低可能會使CDKN1A表達下降,細胞周期停滯變短,從而促進腫瘤發生。

核因子kappa B(NF-κB)參與細胞對外界刺激的響應,在細胞的炎癥反應和免疫應答中起關鍵作用。NFKBIA是NF-κB復合物抑制蛋白IκB的編碼基因,可與NF-κB結合,并阻止其向核內轉移。研究表明,CWAS組大鼠的回腸末端,NF-κB信號通路和炎癥因子的活化會介導低度黏膜炎癥[25]。NF-κB信號通路會引起促炎因子的表達,促炎因子的表達又會進一步促進NF-κB信號通路的活化,從而使腸道黏膜通透性增強,導致腸易激綜合征[26]。NFKBIA在脊髓背角中的上調,可能是對NF-κB信號通路活化的響應,其作用或許是抑制過度活化的NF-κB信號通路。我們推測,在CWAS中,NF-κB信號通路的活化與抑制蛋白IκB表達的上調同時存在。

巨噬細胞加帽蛋白(CapG)屬于凝溶膠蛋白超家族之一,參與細胞內信號轉導過程并調控肌動蛋白[27]。在神經系統中,CapG可能會調控樹突棘的成熟[28]。已有研究證實,慢性束縛應激導致大腦的某些區域(如海馬)的樹突棘密度增加,并且糖皮質激素也可以通過調節腦源性神經營養因子(BDNF)調控樹突棘的密度[29]。因此我們推測,在CWAS中,CapG表達的增加可能與突觸的可塑性和內臟敏化有關。

Apold1是在內皮細胞中鑒定出的一種基因,可對不同刺激(包括缺血、細胞因子和壓力等)做出反應,該基因在血管內皮中的缺失會增加凝血并促進血栓形成[30]。最新的研究表明,Apold1作為一種炎癥標志物可在精神分裂癥患者的海馬中增加,提示可能參與了神經系統的炎癥反應[31]。IBS除了腸道中的黏膜炎癥外,神經炎癥常通過腦腸軸參與IBS的病理過程,從而導致神經—內分泌等一系列生理病理變化[32]。CWAS中的Apold1表達增加,可能是神經系統炎癥所致。我們還需要更多的數據才能明確其功能。

3-磷酸甘油脫氫酶-1(Gpd1)和丙酮酸脫氫酶激酶-4(Pdk4)都與機體能量代謝有關。Gpd1的功能是催化磷酸二羥丙酮(DHAP)和α-磷酸甘油之間的轉化,與人體的肥胖有關并與體質量指數(BMI)成正相關[33]。Pdk4是調節丙酮酸脫氫酶復合物(PDC)的關鍵酶,禁食和高脂飲食的刺激下,Pdk4在組織中的活性明顯增加,心臟中Pdk4的過度表達會導致脂肪酸利用率升高和碳水化合物消耗降低[34]。IBS患者可在多種因素的作用下發生水、糖和電解質的代謝紊亂[35]。CWAS組中Gpd1和Pdk4的高表達可能與慢性應激所致的代謝改變有關,具體作用方式還需要進一步研究。

結締組織生長因子(CTGF)參與神經系統的炎癥反應或損傷修復過程。大鼠星形膠質細胞分泌的CTGF可通過活化星形膠質細胞中的ASK-p38/JNK-NF-κB/AP-1信號通路,以自分泌的方式激活星形膠質細胞,并促進星形膠質細胞介導的炎癥反應[36]。CWAS組中CTGF表達顯著升高可能參與了神經系統炎癥反應,其機制需要進一步研究。

腫瘤壞死因子受體超家族成員11A(Tnfrsf11a)屬于腫瘤壞死因子及其受體超家族,編碼蛋白體核因子κB的受體激活劑(RANK)[37]。RANK是核因子κB受體活化因子配基(RANKL)唯一的受體,啟動RANKL-RANK信號通路。該基因的突變會導致Paget骨病、擴張性高磷血癥和家族膨脹性骨溶解[38]。研究表明,RANKL-RANK信號通路可通過小膠質細胞中的Toll樣受體信號通路減輕小鼠缺血性腦病中的炎癥[39],并且,RANKL可以在發育過程中直接作用于神經元的軸突,并抑制其生長[40]。目前尚不清楚在CWAS中Tnfrsf11a的上調是否為機體對慢性應激所致輕度炎癥的響應,還需要進一步研究。

到目前為止,IBS仍然對人們造成極大的困擾。隨著科學的發展,人們希望能找到新型的生物標志物來幫助對IBS進行診斷,并且更好地理解IBS的病理生理,尤其是在基因組、蛋白質組和轉錄組等層面深入了解IBS的發病機制。我們在本研究中,使用嚙齒類動物的避水應激模型模擬人類的IBS,通過轉錄組學的方法篩選出表達異常的基因,為進一步研究提供參考。