miR-223、miR-324-5p與慢性乙肝肝纖維化的相關(guān)性及其臨床診斷價(jià)值

楊 荔,王海霞,孟小芬,田銀娣,薛云珠,白小龍,逯 云,路 燕,雷煥勤,孫 蕾,盧 樂

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科,西安 710004;2西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院外科;3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科;*通訊作者,E-mail:369758180@qq.com)

慢性乙型肝炎患者的肝纖維化過程為一個(gè)動(dòng)態(tài)的進(jìn)展過程,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、炎癥等過程均參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[1]。目前抗病毒治療是慢性乙型肝炎的主要治療思路,而肝纖維化的程度是抗病毒治療的重要指征,準(zhǔn)確地評(píng)估肝纖維化的程度能夠?yàn)榕R床慢性乙型肝炎的治療時(shí)機(jī)及方法的選擇提供思路[2]。肝組織活檢費(fèi)用較高,且屬于有創(chuàng)檢查方法,患者的接受度一般。近年來,關(guān)于肝纖維化的無創(chuàng)診斷方法的研究是國內(nèi)外學(xué)者探索的熱點(diǎn),血清學(xué)指標(biāo)、生物學(xué)標(biāo)志物等在肝纖維化的診斷中均取得了一定的進(jìn)展[3,4]。miR-223近幾年被發(fā)現(xiàn)與肝炎、酒精性肝損傷、藥物性肝損傷有關(guān)[5-7],近期又被報(bào)道可參與其他器官如心肌細(xì)胞纖維化的過程[8];近年有少許研究報(bào)道m(xù)iR-324-5p可能與肝癌[9]及酒精性肝損傷[10]、炎癥反應(yīng)所致肝損傷[11]有關(guān),但是miR-223和miR-324-5p與乙型病毒性肝炎及肝纖維化的關(guān)系尚不明確。因此,本研究對(duì)miR-223和miR-324-5p在乙型病毒性肝炎及肝纖維化中的表達(dá)情況進(jìn)行觀察,并分析其與肝纖維化的關(guān)系以及對(duì)病情的評(píng)估作用,以期為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供導(dǎo)向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為前瞻性研究,隨機(jī)選取本院2018年1月至2019年12月收治的80例慢性乙型肝炎患者為乙肝組;男45例,女35例;平均年齡(42.54±8.23)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《慢性乙型肝炎防治指南》[12]的診斷標(biāo)準(zhǔn);乙型肝炎表面抗原連續(xù)6個(gè)月以上檢測(cè)為陽性;乙型肝炎病毒基因≥105 IU/ml;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶高于正常水平的1-2倍。排除標(biāo)準(zhǔn):甲型、丙型、戊型肝炎患者;酒精性肝病、藥物性肝損傷患者;合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病的患者;患有惡性腫瘤的患者;合并腦血管疾病的患者。80例乙肝組患者根據(jù)肝組織活檢Metavir評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]判斷其肝纖維化程度,其中F0級(jí)(無纖維化)20例,F1級(jí)(局限性纖維化)24例,F2級(jí)(擴(kuò)大纖維化)12例,F3級(jí)(無肝硬化)14例,F4級(jí)(肝硬化)10例。將乙肝組根據(jù)有無發(fā)生肝纖維化分為無肝纖維化組(20例,F0級(jí))和肝纖維化組(60例,F1-F4級(jí)):無肝纖維化組,男11例,女9例,平均年齡(44.10±9.12)歲;肝纖維化組,男34例,女26例,平均年齡(42.02±7.93)歲。隨后再將乙肝組根據(jù)肝纖維化程度分為輕中度肝纖維化組(44例,F0-F1級(jí))和重度肝纖維化組(36例,F2-F4級(jí)):輕中度肝纖維化組,男24例,女20例,平均年齡(42.73±8.13)歲;重度肝纖維化組,男21例,女15例,平均年齡(42.31±8.47)歲。

另選取同期在本院進(jìn)行體檢的80例健康者為對(duì)照組;男40例,女40例;平均年齡(42.48±8.30)歲。

各組基線年齡、性別均具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.20171202),符合知情同意原則。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-223和miR-324-5p水平檢測(cè) 采集受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml離心后取血漿,Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用SYBR RT-PCR試劑盒行RT-PCR,引物設(shè)計(jì)見表1。以U6為管家基因計(jì)算血清中miR-223和miR-324-5p的相對(duì)表達(dá)水平2-ΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-管家基因Ct值),行3次平行實(shí)驗(yàn)后求均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差并進(jìn)行不同組組間比較。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.2 血清miR-223和miR-324-5p水平與乙型肝炎肝纖維化的關(guān)系 分析并比較無肝纖維化組與肝纖維化組乙型肝炎患者血清miR-223、miR-324-5p水平的差異,并分析血清miR-223、miR-324-5p水平與乙型肝炎肝纖維化發(fā)生情況的關(guān)系。

1.2.3 診斷效能分析 分別將《慢性乙型肝炎防治指南》[12]和Metavir評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]作為乙型肝炎和肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行血清miR-223和miR-324-5p水平單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積(AUC)分析和診斷效能分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-223和miR-324-5p水平比較

t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,乙肝組患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肝纖維化組患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均顯著高于無肝纖維化組患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);重度肝纖維化組患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均顯著高于輕中度肝纖維化組患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組血清miR-223和miR-324-5p水平比較

2.2 血清miR-223和miR-324-5p水平與乙型肝炎肝纖維化的關(guān)系

采用逐步回歸的方法,對(duì)miR-223和miR-324-5p水平與乙型肝炎肝纖維化的關(guān)系進(jìn)行二元Logis-tics(無肝纖維化=0,肝纖維化=1),最終擬合方程logit(P)=-5.414+4.508×miR-223(見表3),提示miR-223是肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 miR-223和miR-324-5p水平與乙型肝炎肝纖維化關(guān)系的二元Logistics回歸分析

2.3 兩指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乙型肝炎的ROC曲線及診斷效能分析

將miR-223和miR-324-5p共同納入乙型肝炎診斷的ROC曲線分析,miR-223和miR-324-5p各自單獨(dú)及兩者聯(lián)合在乙型肝炎診斷中的AUC分別為0.855,0.818,0.879,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-223診斷乙型肝炎的最佳分界點(diǎn)為1.36,miR-324-5p為1.45,以miR-223和miR-324-5p的最佳分界點(diǎn)為乙型肝炎的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乙型肝炎的診斷效能,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)的準(zhǔn)確度、特異度均優(yōu)于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)(見圖1,表4)。

圖1 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乙型肝炎的ROC曲線

表4 miR-223和miR-324-5p診斷乙型肝炎R(shí)OC曲線下方面積(AUC)及診斷效能

2.4 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷重度肝纖維化的ROC曲線及診斷效能分析

將miR-223和miR-324-5p共同納入重度肝纖維化診斷的ROC曲線分析,miR-223和miR-324-5p及兩者聯(lián)合在重度肝纖維化診斷中的AUC分別為0.792,0.676,0.830,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-223診斷重度肝纖維化的最佳分界點(diǎn)為1.49,miR-324-5p為1.64,以miR-223和miR-324-5p的最佳分界點(diǎn)為重度肝纖維化的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)重度肝纖維化的診斷效能,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)的準(zhǔn)確度、敏感度均優(yōu)于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)(見表5,圖2)。

表5 miR-223和miR-324-5p診斷重度肝纖維化ROC曲線下方面積(AUC)及診斷效能

圖2 miR-223和miR-324-5p單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷重度肝纖維化的ROC曲線

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化過程中的主要病理學(xué)改變,在此過程中,肝星狀細(xì)胞活化機(jī)制是目前學(xué)者們研究的熱點(diǎn),也是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[14]。micorRNA是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA,可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶基因,參與多種生物調(diào)節(jié)途徑。經(jīng)證實(shí),在肝星狀細(xì)胞活化過程中,多種micorRNA均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,但國內(nèi)外關(guān)于micorRNA在肝炎或肝纖維化診斷中作用的相關(guān)研究目前較少[15]。

miR-223定位在X染色體q12上,其表達(dá)受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,參與人體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、感染、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多方面的病理生理調(diào)控過程[16],有研究發(fā)現(xiàn),其在肝細(xì)胞癌患者血清中的含量較健康人群明顯增高[17]。一項(xiàng)肝臟損傷動(dòng)物模型的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-223的轉(zhuǎn)錄水平與肝損傷的血清學(xué)標(biāo)記物之間為顯著正相關(guān)關(guān)系,提示miR-223的異常表達(dá)參與了肝損傷的關(guān)鍵過程[18],且最新研究也發(fā)現(xiàn),miR-223的靶基因數(shù)量接近40個(gè),在肝癌等腫瘤的病理生理過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。miR-324-5p基因定位于染色體17p13.1,經(jīng)證實(shí)與多種人類腫瘤有關(guān)[9],并且在肝細(xì)胞癌中也呈高表達(dá)[10]。董曉龍[11]研究發(fā)現(xiàn),采用乙醇刺激人肝癌細(xì)胞株Bel7402以及大鼠正常肝細(xì)胞株BRL后,miR-324-5p表達(dá)上調(diào),提示miR-324-5p參與了乙醇所致肝細(xì)胞損傷。韓永艷等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-324-5p是急性胰腺炎肝損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并且miR-324-5p可用于預(yù)測(cè)急性胰腺炎并發(fā)肝損傷,提示miR-324-5p可能和炎癥反應(yīng)所致肝細(xì)胞損傷有關(guān),但具體作用機(jī)制不明。綜上所述,盡管目前對(duì)micorRNA在肝損傷以及肝纖維化中的研究較多[21],但是目前圍繞miR-223和miR-324-5p與乙型病毒性肝炎及肝纖維化的關(guān)系研究較少。

陳超[22]在對(duì)肝纖維化大鼠模型肝組織及原代肝星狀細(xì)胞的研究中,對(duì)肝纖維化相關(guān)的micorRNA進(jìn)行了篩選和功能研究,研究結(jié)果顯示miR-223和miR-324-5p在肝纖維化過程中的表達(dá)均為明顯升高狀態(tài);生物學(xué)信息分析結(jié)果也提示,miR-223和miR-324-5p在肝星形細(xì)胞的活化中可能參與了肝星形細(xì)胞的遷移。在本研究中,乙肝組患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均顯著高于對(duì)照組,表明在慢性乙型肝炎病毒感染患者的血清中,miR-223和miR-324-5p均處于表達(dá)上調(diào)的狀態(tài);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),肝纖維化患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均顯著高于無肝纖維化組患者,而重度肝纖維化組患者血清中miR-223和miR-324-5p水平均顯著高于輕中度肝纖維化組患者,進(jìn)一步印證了陳超[22]的研究結(jié)論。隨后,為了進(jìn)一步分析miR-223和miR-324-5p與乙型肝炎及肝纖維化程度的關(guān)系,并探討兩者在乙型肝炎及肝纖維化程度診斷中的診斷價(jià)值,我們首先通過二元Logistics逐步回歸分析,證實(shí)miR-223是乙肝感染患者發(fā)生肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但是由于無肝纖維化組患者樣本量相對(duì)較少,而且所納入研究的協(xié)變量較少,因此導(dǎo)致95%置信區(qū)間上限較大,因此,仍需進(jìn)一步納入更大樣本量以及觀測(cè)指標(biāo)以進(jìn)行深入研究。隨后,我們通過對(duì)miR-223和miR-324-5p水平在乙型肝炎及肝纖維化程度診斷中的效能進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-223和miR-324-5p及兩者聯(lián)合可用于乙型肝炎和重度肝纖維化的診斷,而且兩者聯(lián)合能夠大大提升乙型肝炎和重度肝纖維化診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述,miR-223可能是乙肝感染患者發(fā)生肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;外周血miR-223和miR-324-5p水平可有效反映乙型肝炎病毒的感染情況和肝纖維化程度,同時(shí)監(jiān)測(cè)兩者表達(dá)水平,有助于對(duì)肝纖維化程度的判斷。因此,在今后的研究中,我們將進(jìn)一步圍繞miR-223和miR-324-5p與乙肝肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,從分子生物學(xué)水平進(jìn)行深入研究。