MALDI-TOF-MS在兒童血流及尿路感染病原菌直接鑒定中的應用

王 林,王 媚,王 維

(1西安市第一醫院檢驗科,西安 710002;2西北有色醫院檢驗科;3西安市兒童醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:doctordian.dian@163.com)

細菌感染是威脅兒童健康的主要病因之一,而病原菌診斷的“金標準”仍依賴于傳統細菌培養。細菌種類多、培養條件要求不一且耗時較長,此已成為限制微生物檢驗診斷學的關鍵環節[1,2]。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)在臨床微生物檢驗的應用大大縮短了鑒定時間,快速、敏感、高效的特點使其廣泛應用于臨床微生物鑒定,顯著降低了樣本檢測的時間成本和經濟成本[3]。此技術不但可以直接鑒定單個純化菌落,而且直接進行無菌體液樣本(腦脊液、血液、膽汁、胸腹水)細菌鑒定,成為近年來研究熱點[4-7]。由于直接鑒定的不穩定型導致此項技術在臨床仍未大規模開展,但近年來商品化的試劑盒加速了標本質譜直接鑒定的發展。本研究利用Microflex LT型全自動快速生物質譜監測系統及MALDI Sepsityper試劑盒直接鑒定血培養報警陽性標本及尿常規提示細菌感染陽性尿標本,比較直接鑒定與傳統單個菌落鑒定結果符合情況,探究此快速鑒定方法的臨床價值,為患兒病原菌的及時診斷提供一個有效可行的實驗室檢測手段。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 血培養陽性報警標本 收集西安市兒童醫院檢驗科微生物室2019年10月至2020年6月血培養報警陽性標本382份(報警時間<48 h),剔除同一人同一天報警的重復標本。364份標本為單一菌感染,18份標本為兩種及兩種以上菌混合感染,其中分離出革蘭陽性菌89株,革蘭陰性菌271株,念珠菌4株。

1.1.2 尿液標本 收集西安市兒童醫院檢驗科微生物室2019年10月至2020年6月尿液標本265份。所有尿標本要求同一天送檢尿常規結果白細胞及白細胞酯酶陽性,提示有尿路感染的標本進行質譜直接鑒定。

1.2 儀器試劑

1.3 檢測方法

1.3.1 血培養報警陽性標本 取1 ml陽性血培養標本置于1.5 ml EP管,根據試劑說明書,加入細胞裂解液渦旋震蕩離心,吸取上清加入清洗液中混勻,再次離心,吸上清應用甲酸提取法得到細菌蛋白樣品,取1 μl靶板點樣進行質譜鑒定。

1.3.2 提示尿路感染尿液標本 采用差速離心法富集細菌。取尿液標本1 ml置于EP管中,2 000g離心30 s,取上清,16 000g離心5 min棄上清向沉渣中加入0.9%氯化鈉溶液500 μl震蕩混勻后12 000g離心5 min,棄上清,加1 ml去離子水洗滌沉淀,再次離心棄去上清液。取濃集的細菌標本1 μl靶板點樣,溫自然干燥后加1 μl 70%甲酸破壞細胞壁,室溫干燥后再加1 μl 70%甲酸2次破壁,自然干燥后加1 μl基質液晾干進行質譜鑒定。收集尿路感染常見細菌配制稀釋不同濃度菌懸液,采用上述方法質譜直接鑒定,分析其鑒定濃度檢測低限。

1.3.3 鑒定結果判斷 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀首先采集的每個樣本指紋圖譜,利用軟件BioTyper和FlexAnalysis比對分析,得到分類結果報告分值。結果得分判定標準:0.000-1.699,不可靠的鑒定(紅色);1.700-1.999,可能的屬水平鑒定(黃色);2.00-2.299,確定的屬水平鑒定或可能的種水平鑒定(綠色);2.300-3.000,高置信度的種水平鑒定(綠色)。

1.3.4 數據統計分析 數據采用SPSS 20.0進行統計分析。計數資料以率表示,組間比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兒童常見單一菌血流感染質譜直接鑒定和培養后菌落鑒定結果比較

單一菌血流感染,共分離出革蘭陽性菌219株,革蘭陰性菌133株,真菌12株。MALDI-TOF-MS直接鑒定與培養后菌落鑒定結果進行比較,革蘭陽性菌兩者鑒定符合率為84.3%(177/210),革蘭陰性菌鑒定符合率為88.4%(114/129),真菌鑒定符合率為44.4%(4/9)。MALDI-TOF-MS直接鑒定革蘭陰性菌鑒定率高于革蘭陽性菌,分別與菌落鑒定率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。真菌直接鑒定與菌落鑒定比較,鑒定率差異有統計學意義(P<0.05),具體各類菌鑒定菌株數及鑒定率見表1。

表1 質譜血流感染直接鑒定與培養后菌落鑒定結果比較 株(%)

2.2 單一菌血流感染質譜直接鑒定和培養后菌落鑒定分值及曲線比較

MALDI-TOF-MS直接鑒定血培養報警陽性瓶,本研究發現鑒定結果一致時,直接鑒定分值低于菌落鑒定(見圖1),質譜直接鑒定大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌的評分依次為1.882,1.967,1.653,而培養后菌落鑒定評分較高,分別為2.298,2.289,1.98。觀察細菌指紋圖譜發現在峰值基本一致情況下,即蛋白含量相近條件時,菌落鑒定較直接鑒定細菌特征峰數量多,干擾雜峰少,匹配結果較好。

紅色為質譜直接鑒定曲線,藍色為質譜菌落鑒定曲線

2.3 兒童常見單一菌尿路感染質譜直接鑒定和培養后菌落鑒定結果比較

收集檢測并統計分析菌落計數≥105cfu/ml的尿培養標本264份,覆蓋兒童尿路感染常見細菌,包括革蘭陰性菌、陽性菌及真菌。大腸埃希菌質譜直接鑒定符合率最高(92.2%),真菌直接鑒定率較低,白色念珠菌共11株,僅3株直接鑒定到種屬,多數結果為不可靠鑒定。總體尿路感染標本細菌直接鑒定符合率為83.3%(221/265),各種細菌直接鑒定具體結果見表2。

表2 兒童常見單一菌尿路感染質譜直接鑒定與培養后菌落鑒定結果比較 株(%)

2.4 兒童尿路感染常見菌不同檢測濃度質譜鑒定評分情況

對兒童尿路感染常見的革蘭陰性菌及陽性菌進行倍比稀釋,模擬尿路感染不同細菌濃度情況,采用差速離心法離心后進行質譜鑒定。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌及糞腸球菌不同濃度菌液行質譜鑒定得出鑒定結果評分見表3。尿路感染中此四種常見菌直接質譜鑒定最低檢測限度分別為1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。

表3 兒童常見單一菌尿路感染質譜直接鑒定細菌濃度及對應評分

3 討論

兒童免疫力低,細菌感染后病情發展迅速,早期且準確的病原學檢測結果對患兒的診治尤為重要,可顯著降低用藥不當所致的病死率和住院費用,快速捕捉病原菌已成為國內外微生物臨床應用的研究熱點。MALDI-TOF-MS是近年發展起來的一種新型細菌鑒定技術,可以快速準確地進行菌種鑒定,對培養后菌落的鑒定在臨床已應用成熟。該菌落鑒定技術具有高度穩定性及準確性,極大縮短了菌株的傳統鑒定時間,其成本也遠低于傳統生化鑒定[8,9]。現階段MALDI-TOF-MS技術對于標本的直接鑒定仍然為實驗室檢測的難點。不同方法處理血培養陽性標本后質譜直接鑒定的研究一直不斷,但不同前處理方法可直接影響其鑒定效果及結果判定[10-12]。

本研究選取臨床常見的兩類無菌體液標本,血培養陽性報警標本采用質譜儀配套前處理試劑盒提蛋白后進行直接質譜鑒定;尿路感染患兒尿液標本,采用差速離心法,離心取菌液沉淀直接質譜鑒定。血培養標本直接質譜鑒定結果顯示,革蘭陽性菌、陰性菌、真菌的鑒定符合率分別為84.3%,88.4%,44.4%,革蘭陽性菌及陰性菌質譜直接鑒定與菌落鑒定結果比較無顯著差異(P>0.05),真菌直接鑒定結果不理想,與菌落質譜鑒定結果存在較大差異,此與近年來國內外研究一致[13]。此結果提示對于臨床血培養陽性報警標本,若涂片提示非真菌,即可直接進行質譜鑒定確定菌種,以具體菌名的方式向臨床發出一級預警報告,從而取代傳統的僅有涂片結果的一級報告模式,為臨床選擇抗菌藥物提供快速、準確的病原學證據。直接鑒定與菌落鑒定的細菌指紋圖譜及結果評分對比發現,菌落鑒定圖譜的特征峰數量多,干擾雜峰少,匹配結果較好,結果分值較高,為2.00-2.299確定的屬水平鑒定或可能的種水平鑒定(綠色)。此外,該研究發現對于報陽時間較長、生長較緩慢的細菌,直接鑒定結果不理想,這與慢生長菌濃度低有一定關系。尿液標本質譜直接鑒定過程中甲酸破壁步驟進行了兩次,發現該實驗兩遍甲酸處理相對一次鑒定結果更好,對于常見尿路感染菌大腸埃希菌及糞腸球菌鑒定符合率達90%以上。真菌鑒定結果符合率僅27.3%,低于同類研究結果,因為其他實驗者自建的真菌鑒定評分截點為1.50,低于常規鑒定評分標準[14]。兒童尿路感染常見菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌及糞腸球菌)質譜直接鑒定最低檢測限度分別為1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。眾所周知,對于單純泌尿系感染的患兒,其尿液細菌濃度判斷閾值通常為105cfu/ml,結合本研究結果提示微生物檢驗人員對于臨床明確診斷的泌尿系感染患兒尿培養標本可進行質譜直接鑒定,縮短報告時間并指導臨床及時用藥,同時為探索尿培養標本進行直接藥敏試驗提供了新思路。

該研究發現對于尿液標本的直接鑒定,需注意以下幾點:菌量多時峰圖信號好,檢測結果可靠,分值高;尿常規顯示蛋白尿時,蛋白等雜質干擾掩蓋檢測信號,鑒定會受影響,與其他研究一致[15];兩種混合生長的細菌鑒定結果不理性。有研究報道,對有兩種混合生長細菌的尿液標本MALDI-TOF-MS技術鑒定結果較差,尤其兩種菌存在優劣勢生長時,往往僅能鑒定出優勢生長的細菌[16]。此時,可根據離心后涂片鏡檢結果不同微生物采用不同的預處理方法,保證結果準確性。

綜上所述,本研究采用不用的前處理方法,利用MALDI-TOF-MS快速直接對血培養報警陽性瓶及尿路感染尿液標本進行鑒定,對兒童常見感染菌結果與傳統菌落鑒定符合率較高。本方法實用性強,可在急重癥感染患兒中進行臨床推廣,以快速檢測病原菌,可作為實驗室傳統鑒定方法的有效補充,及時為臨床選擇抗菌藥物提供病原學證據。隨著研究的不斷深入,標本前處理方法的不斷成熟,相信MALDI-TOF-MS細菌直接鑒定及直接藥敏試驗的應用,會為臨床診治提供更好的實驗室支持和幫助。