長(zhǎng)鏈非編碼RNA XLOC-013014在腎癌組織中的表達(dá)及對(duì)腎癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

潘 良,王宇雄,卞亭長(zhǎng),酈俊生,林文耀

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院泌尿外科,上海 200030;*通訊作者,E-mail:phmolon@163.com)

腎癌是最常見(jiàn)的腎原發(fā)性惡性腫瘤,進(jìn)展較快、惡性程度較高、預(yù)后較差,嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康[1]。腎癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,研究腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。人類(lèi)基因組中的大部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均為非編碼RNA,其中長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lnc-RNA)是非編碼RNA的重要組成部分[2]。近年來(lái),研究表明lncRNA可參與多種疾病包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,與腫瘤的惡性生物學(xué)行為如增殖、遷移、凋亡、分化等相關(guān)[3]。lncRNA在腎癌中的作用日益受到關(guān)注[4]。XLOC-013014作為lncRNA家族的重要成員,長(zhǎng)度為494個(gè)核苷酸,屬于基因內(nèi)lncRNA,其在腫瘤特別是腎癌中所起的作用及下游分子通路有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在觀察XLOC-013014在腎癌組織和細(xì)胞中的表達(dá),并通過(guò)轉(zhuǎn)染XLOC-013014質(zhì)粒至腎癌細(xì)胞,探究XLOC-013014對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

37例腎癌組織和癌旁組織來(lái)源于2016年11月至2018年10月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的標(biāo)本,保存于液氮中。患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療,標(biāo)本均經(jīng)兩位以上病理專(zhuān)家確認(rèn),37例腎癌組織均為腎透明細(xì)胞癌。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。腎癌細(xì)胞株(CaKi-1、786-O、A498、ACHN)和正常腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)購(gòu)自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心,細(xì)胞均采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。含有XLOC-013014全長(zhǎng)的質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海捷瑞生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。一抗β-微管蛋白(β-Tubulin)、Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(KLF2)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、蛋白激酶B(AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A498細(xì)胞接種6孔板,隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,分別轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和含有XLOC-013014全長(zhǎng)的質(zhì)粒。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%融合時(shí),根據(jù)LipofectamineTM2000 Reagent說(shuō)明書(shū)通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒稀釋,稀釋液混勻靜置15 min,分別滴加至6孔板。轉(zhuǎn)染24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因 采用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)XLOC-013014的靶miRNA,采用TargetScan Release 3.1在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)相應(yīng)miRNA的靶基因。

1.2.3 qPCR檢測(cè)XLOC-013014、miR-342-3p和KLF2 mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑提取腎癌組織和細(xì)胞中總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。以GAPDH或U6為內(nèi)參,分別檢測(cè)XLOC-013014、miR-342-3p和KLF2 mRNA的表達(dá)。根據(jù)qPCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán),特異性引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR特異性引物序列

1.2.4 Western blotting檢測(cè)KLF2蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá) A498細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,PBS溶液反復(fù)洗滌細(xì)胞3次,細(xì)胞裂解液在冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白,每組取60 μg總蛋白,通過(guò)SDS-PAGE電泳分離后,半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。5%脫脂牛奶稀釋一抗(p-AKT、KLF2、p-mTOR、AKT、mTOR)和山羊抗兔二抗,一抗按1∶1 000進(jìn)行稀釋,4 ℃孵育過(guò)夜。山羊抗兔二抗按1∶5 000進(jìn)行稀釋,室溫下孵育1 h,洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影,比較各組蛋白表達(dá)量。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 A498細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,胰酶消化并使用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,分別以每孔4×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板,連續(xù)培養(yǎng)并檢測(cè)5 d。在每天相同時(shí)間點(diǎn),每孔分別加入20 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)4 h后,采用酶標(biāo)儀讀取每孔在490 nm處的吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 A498細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,胰酶消化并使用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞密度調(diào)整為3×105個(gè)/ml,取每組200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中,下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出小室,采用甲醇固定30 min,采用結(jié)晶紫溶液染色30 min,PBS溶液沖洗。待小室基底膜風(fēng)干后,每組在倒置顯微鏡下選取4個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù),取平均值比較不同組A498細(xì)胞遷移能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腎癌組織和癌旁組織中XLOC-013014的表達(dá)

XLOC-013014在腎癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)分別為1.08±0.32和4.07±0.57,XLOC-013014在腎癌組織中的相對(duì)表達(dá)顯著少于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與癌旁組織相比,**P<0.01

2.2 腎癌細(xì)胞株中XLOC-013014的表達(dá)

XLOC-013014在腎癌細(xì)胞株(CaKi-1、786-O、A498、ACHN)和正常腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中的相對(duì)表達(dá)分別為0.80±0.02,0.34±0.03,0.11±0.01,0.62±0.04和1.00±0.05,XLOC-013014在腎癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)均少于正常腎小管上皮細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),在A498細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)最低(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

與HK-2相比,**P<0.01

2.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)XLOC-013014的靶基因

采用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)XLOC-013014的靶基因是miR-342-3p,采用TargetScan Release 3.1在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-342-3p的靶基因是KLF2(見(jiàn)圖3)。

圖3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)XLOC-013014的靶基因

2.4 兩組A498細(xì)胞中XLOC-013014、miR-342-3p和KLF2 mRNA的表達(dá)

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞中XLOC-013014的相對(duì)表達(dá)分別為1.02±0.11和12.61±1.17,實(shí)驗(yàn)組中XLOC-013014的相對(duì)表達(dá)顯著增加(P<0.01)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞中miR-342-3p的相對(duì)表達(dá)分別為1.00±0.04和0.24±0.06,實(shí)驗(yàn)組中miR-342-3p的相對(duì)表達(dá)顯著減少(P<0.01)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞中KLF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別為1.47±0.75和6.68±0.98,實(shí)驗(yàn)組中KLF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)顯著增加(P<0.01)。

2.5 KLF2和PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化

對(duì)2.4中成功轉(zhuǎn)染XLOC-013014質(zhì)粒的細(xì)胞系進(jìn)行Western blotting檢測(cè),細(xì)胞中KLF2蛋白表達(dá)升高,PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白如p-AKT、p-mTOR表達(dá)降低,AKT、mTOR蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖4)。

圖4 Western blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞中KLF2蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

2.6 XLOC-013014對(duì)腎癌A498細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)兩組A498細(xì)胞的增殖能力,酶標(biāo)儀檢測(cè)并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞由第3天開(kāi)始,細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著減慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5),提示XLOC-013014可以抑制A498細(xì)胞的增殖能力。

與對(duì)照組相比,*P<0.05

2.7 XLOC-013014對(duì)腎癌A498細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組A498細(xì)胞的遷移能力,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞在24 h的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(153.60±20.34)個(gè)和(81.79±13.55)個(gè),實(shí)驗(yàn)組A498細(xì)胞遷移能力顯著少于對(duì)照組(P<0.05,見(jiàn)圖6),提示XLOC-013014可抑制A498細(xì)胞的遷移能力。

與對(duì)照組相比,*P<0.05

3 討論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)由于不具有編碼蛋白的功能,起初被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能,只是基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的“噪音”[5]。近年來(lái)的研究表明,lncRNA可在眾多層面如表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),參與疾病包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、防治、預(yù)后等密切聯(lián)系[6]。研究顯示,TP73-AS1[7]、ENSG00000241684[8]、FENDRR[9]、HOTTIP[10]等多條lncRNA在腎癌中異常表達(dá),參與調(diào)控腎癌的惡性生物學(xué)行為,在腎癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。XLOC-013014是真正意義的lncRNA,由于缺乏開(kāi)放閱讀框,XLOC-013014無(wú)法作為編碼蛋白的模板,其在腎癌中的表達(dá)及其對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、遷移的影響,目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)腎癌組織和細(xì)胞中XLOC-013014的表達(dá),發(fā)現(xiàn)XLOC-013014在腎癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,提示XLOC-013014可能成為一種新型的腎癌診斷標(biāo)志物。在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498中,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入含有XLOC-013014全長(zhǎng)的質(zhì)粒,可顯著提高A498細(xì)胞中XLOC-013014的表達(dá)。

多項(xiàng)研究表明,LncRNA可通過(guò)“海綿樣”方式結(jié)合并下調(diào)多種miRNA的活性,進(jìn)而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),介導(dǎo)腫瘤的表觀遺傳調(diào)控[5,11]。采用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)XLOC-013014的靶基因是miR-342-3p。通過(guò)高表達(dá)A498中XLOC-013014的表達(dá),發(fā)現(xiàn)XLOC-013014表達(dá)增加后,miR-342-3p表達(dá)降低,XLOC-013014可能具有吸附并降低miR-342-3p表達(dá)的作用。采用TargetScan Release 3.1在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-342-3p的靶基因是Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(KLF2)。KLF2基因定位于染色體10p13.1,由1 655個(gè)堿基組成[12]。KLF2蛋白作為KLF家族中重要的轉(zhuǎn)錄因子,由354個(gè)氨基酸組成,參與調(diào)控血管張力、血管形成、血管新生等重要過(guò)程,在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要[13,14]。近年來(lái),KLF2在惡性腫瘤中的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注。KLF2在多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌中表達(dá)降低,發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-342-3p表達(dá)降低可顯著升高KLF2的表達(dá),miR-342-3p可能對(duì)KLF2的表達(dá)發(fā)揮干擾作用。有研究表明,KLF2蛋白主要通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。A498細(xì)胞中KLF2蛋白表達(dá)升高后,PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白如p-AKT、p-mTOR表達(dá)顯著降低,提示PI3K/AKT信號(hào)通路被阻滯。本研究進(jìn)一步通過(guò)CCK-8法和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明,XLOC-013014表達(dá)增加后,A498細(xì)胞的增殖能力和遷移能力顯著降低,表明XLOC-013014可抑制A498細(xì)胞的體外增殖能力和遷移能力。

綜上所述,XLOC-013014在腎癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá),XLOC-013014可通過(guò)“海綿樣”方式結(jié)合并抑制miR-342-3p的表達(dá),從而間接促進(jìn)KLF2基因的表達(dá),阻滯PI3K/AKT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腎癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。XLOC-013014可能在腎癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,具有成為腎癌潛在的新的分子靶標(biāo)的價(jià)值。