低頻超聲聯合5-FU對結腸癌HT-29細胞生物學特性的影響

李 艷,羅栩偉,朱冬梅,楊 姣,張英娟,張 慧,陳思佳,劉 剛,劉學彬*

(1南充市中心醫院,川北醫學院第二臨床醫學院超聲科,南充 637000;2南充市中心醫院,川北醫學院第二臨床醫學院骨科；*通訊作者,E-mail:540677374@qq.com)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上第三大常見癌癥,目前化療仍然是結腸癌患者的一線治療方法,但由于耐藥性的產生,結腸癌易復發轉移,死亡率仍然居高不下[1,2]。研究發現[3-5]腫瘤細胞中有一小群具有干性的細胞,在腫瘤異質性的形成和獲得抗藥性中起關鍵作用,被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs),是影響結腸癌耐藥性獲得和復發轉移過程的主要原因。因此,靶向結腸癌中的腫瘤干細胞是改善結腸癌患者的治療療效和生存期的關鍵。

聲動力療法(sonodynamic therapy,SDT)是一種新興的抗腫瘤方法,近年來在癌癥治療中受到重視[6,7]。其中,低頻超聲(low-frequency ultrasound,LFUS)由于空化效應,可在細胞膜上形成小孔,增加大分子物質的攝取,也可誘導敏感細胞發生凋亡,同化療藥物聯合使用,可以產生更好的協同抗腫瘤效果而受到研究者們的青睞[8,9]。在本研究中,我們假設LFUS對結腸癌細胞的刺激可以增強其對化療藥物治療的敏感性,比較有無LFUS刺激的細胞增殖、凋亡差異以及CSCs集落的形態變化等。這將為結腸癌的治療提供一種新的思路和治療方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人結腸細胞系HT-29(購自武漢中國細胞研究中心);無血清高糖細胞DMEM培養基(美國Hyclone公司);10 000 U/ml penicillin和10 000 μg/ml streptomycin(美國Hyclone公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司);0.25%胰酶(美國Hyclone公司);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher);CCK-8試劑盒(中國江蘇凱基生物科技股份有限公司);總RNA提取試劑盒(中國TIANGEN生化科技有限公司);細胞培養箱(美國Thermo公司);核酸擴增儀(美國Thermo公司);BIO-RAD實時熒光定量PCR儀(ICYCLER IQ5)(美國Bio-Rad公司);核酸微量分光光度計(德國Eppendorf公司);旋渦震蕩器(德國Eppendorf公司);高低速離心機(美國Thermo公司);超聲發生器(UP50H)(德國Hielscher)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人結腸癌的普通培養 人結腸癌HT-29細胞培養于DMEM完全培養液(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素)。將HT-29細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養,0.25%的胰酶消化細胞,隔2-3 d傳代1次,取對數生長期的細胞進行腫瘤干細胞球的培養以及細胞增殖實驗。

1.2.2 無血清懸浮培養法(serum-free medium,SFM)富集腫瘤干細胞 收集對數生長期的HT-29細胞,PBS洗滌兩次除去血清,然后用無血清培養基DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)重懸細胞接種到超低黏附的6孔培養板中,培養3 d。DMEM/F12培養基中含非必需氨基酸,N2添加劑(Invitrogen公司),B27添加劑(Invitrogen公司),表皮生長因子(EGF)(20 ng/ml,Invitrogen公司)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,10 ng/ml,Invitrogen公司)。

1.2.3 低頻超聲刺激細胞 采用30 kHz的超聲發生器(UP50H,Hielscher,Germany)連接超聲探頭(MS1,Hielscher,Germany)用于刺激細胞。將要進行低頻超聲刺激的培養板用封口膠四周封緊,固定在泡沫板上,使其能漂浮于水中,培養板底部完全暴露于超聲環境中。將板在30 kHz、密度為1 W/cm2中連續超聲1 min,溫度控制在37 ℃。將要進行超聲的細胞傳在同一細胞培養板,非超聲處理的細胞傳在另外的培養板上。

1.2.4 CCK-8檢測細胞活性 收集對數生長期的HT-29細胞,消化后制備HT-29細胞懸液,再以每孔1×103個/100 μl的細胞懸液接種于96孔板中,培養24 h后,檢測處理前各組細胞活性,然后處理細胞。低頻超聲組:30 kHz,1 W/cm2×1 min超聲處理,僅刺激一次;5-FU組:藥物濃度為10 mg/ml培養24 h;聯合組:疊加處理因素;對照組:不做處理。處理后24,48,72,96 h進行CCK-8檢測。CCK-8檢測細胞活性方法:加入10 μl CCK-8溶液到90 μl培養基中,置換到所需檢測的各孔中,37 ℃孵育1 h,然后使用酶標儀測定450 nm波長處的各孔光吸收值。

1.2.5 低頻超聲和5-FU對CSCs的影響 為了評價和比較低頻超聲和5-FU對CSCs的影響,采用超低黏附6孔板培養CSCs,在集落形成3 d后,對照組僅換為新鮮的DMEM/F12培養基,不做其他處理;低頻超聲組,換液后將細胞暴露于LFUS刺激,每天刺激一次,連續2 d;5-氟尿嘧啶(5-FU)組,換入含5 μg/ml 5-FU的DMEM/F12培養基;聯合組(低頻超聲+5-FU),疊加上述處理即換入含5 μg/ml 5-FU的DMEM/F12培養基,并且每天LFUS刺激一次,連續2 d。每組3個復孔,并進行獨立實驗3次。

1.2.6 熒光定量PCR技術檢測基因表達水平 按照總RNA提取試劑盒說明書,提取處理后的腫瘤干細胞球的總RNA,經逆轉錄得到cDNA。應用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測各組細胞干性相關基因的mRNA表達水平。本研究用CD133、CD44和Sox2的表達水平來表征結腸癌腫瘤干細胞干性的變化。引物序列見表1,GAPDH為內參基因。反應條件為:95 ℃預熱15 min;94 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,共35個循環。每個反應孔的熒光信號達到設定閾值時的循環數即為Ct值。對檢測得到的Ct值以相對定量的方法進行數據分析:miRNA的相對表達量用2-ΔΔCt來計算。每個基因重復反應3次,進行獨立實驗3次。

表1 引物序列

1.2.7 蛋白印跡(Western-blotting)檢測蛋白表達情況 經過處理后的腫瘤干細胞轉移至離心管,2 000 r/min離心5 min,收集細胞沉淀,加入細胞裂解液提取蛋白樣品,BCA蛋白定量試劑盒進行定量。取等量蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉移至醋酸纖維膜(NC)上,5%脫脂奶粉常溫封閉1 h,加一抗4 ℃過夜,洗膜后加二抗孵育1 h。一抗(均購自美國Abcam公司)包括:鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,1∶2 000),兔抗人PARP(1∶100),兔抗人Bcl-2(1∶1 000),兔抗人CD133(1∶1 000),兔抗人CD44(1∶1 000)。常規增強化學發光法曝光、掃描成像。

1.2.8 統計學分析 使用SPSS 17.0統計學軟件進行,計量資料以均數±標準差的方法表示,兩組間采用t檢驗,多組間均數比較采用單因素方差分析以及SNK檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低頻超聲聯合5-FU抑制結腸癌細胞的增殖

經低頻超聲和5-FU聯合處理后,結腸癌細胞變圓、皺縮、喪失細胞形態,與對照組相比有明顯差異(見圖1A)。CCK-8檢測結果顯示,與對照組和單獨處理組比較,低頻超聲和5-FU聯合處理組細胞增殖明顯受到抑制,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖1B)。

圖1 低頻超聲和5-FU抑制HT-29細胞增殖

2.2 低頻超聲聯合5-FU抑制結腸癌干細胞的克隆形成

與control組比較,LFUS組、5-FU組干細胞球數量差異沒有統計學意義。與control組相比,LFUS和5-FU聯合處理組干細胞球體松散,且個體小,數量顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2A)。提取處理48 h的干細胞球總RNA和蛋白,通過qRT-PCR和Western blot檢測干性相關基因CD133、CD44和Sox2的mRNA水平和蛋白表達水平,結果表明與control組比較,LFUS和5-FU聯合處理后干細胞球的干性CD133、CD44和Sox2的mRNA水平下調,同時檢測到CD133、CD44蛋白表達水平也降低(見圖2B和2C)。因此,我們認為低頻超聲聯合5-FU能明顯抑制結腸癌干細胞的克隆形成。

圖2 低頻超聲、5-FU以及聯合組對HT-29 CSCs形成的影響

2.3 低頻超聲促進5-FU誘導結腸癌干細胞凋亡

將經過處理的CSCs細胞用Acctuase酶(Sigma公司)消化成單個細胞后進行凋亡檢測,對照組的凋亡率為(4.38±1.27)%,低頻超聲組的凋亡率為(4.45±1.56)%,5-FU組的凋亡率為(8.2±1.76)%,聯合組的凋亡率為(12.27±1.63)%。低頻超聲組和5-FU組細胞凋亡率與對照組相比,差異沒有統計學意義;與對照組和單獨應用低頻超聲組相比,LFUS和5-FU聯合組凋亡率顯著增加,且差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。進一步Western blot檢測結果顯示,與對照組和低頻超聲組相比,LFUS和5-FU聯合組凋亡蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)裂解片段(cleaved-PARP)明顯增加,同時BCL蛋白家族中的抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調(見圖4)。以上結果提示,低頻超聲可促進5-FU誘導結腸癌干細胞發生凋亡。

左下象限(Q4)顯示活細胞,呈現Annexin Ⅴ-/PI-;右下象限(Q3)為早期凋亡細胞,呈現Annexin Ⅴ+/PI-;右上象限(Q2)為晚期凋亡細胞,呈現Annexin Ⅴ+/PI+;左上象限(Q1)為壞死細胞,呈現Annexin Ⅴ-/PI+

圖4 Western bolt檢測凋亡相關蛋白的表達情況

3 討論

近年來,超聲被報道為最好的藥物釋放觸發技術之一,在腫瘤治療研究中凸顯光芒,這是因為它是一種低成本的非侵入性技術,可以精確地作用于腫瘤組織[10,11]。超聲的治療作用分為熱療和非熱療,其中由低頻超聲產生的非熱空化機械效應具有穿透力強、組織損傷小、對惡性腫瘤細胞敏感等優點,因此低頻超聲在腫瘤治療中具有明顯優勢[12,13]。LFUS可以提高化療藥物的抗癌活性,包括阿霉素[14]、順鉑[15]、5-氟尿嘧啶[16]、環磷酰胺[17]和多西紫杉醇[18],可能的機制是通過超聲波的空化作用,形成聲致孔現象改變了細胞膜和組織膜的通透性。并且,研究表明[19,20]低頻超聲能夠提高包封后的腫瘤靶向藥物在腫瘤的局部濃度,從而抑制腫瘤細胞耐藥,提高療效。

化療是結腸癌患者的一線治療方案,如5-FU可以殺傷普通的腫瘤細胞,但是腫瘤干細胞對化療藥卻不敏感,這也是導致治療失敗的關鍵因素[21]。腫瘤干細胞和正常干細胞一樣具有自我更新的能力,對常規化療和放射治療具有抵抗力,在促使腫瘤復發和遠處轉移過程中起主要作用[22,23]。Oct4和Sox2是常見的干細胞相關蛋白,并且Oct4和Sox2蛋白在CSCs中的表達高于正常癌細胞群體。研究表明[24],CD133和CD44在結腸癌干細胞中高表達。因此,本研究用CD133、CD44和Sox2的表達水平來表征結腸癌腫瘤干細胞的干性的變化。促進CSCs向正常的癌細胞轉化,以消除其自我更新能力、增強CSCs對化學藥物敏感性,是近年抗腫瘤治療研究的熱點之一[25-27]。本項研究聯合低頻超聲和5-FU用于抗結腸癌,結果表明低頻超聲可以顯著增強5-FU抗結腸癌細胞活性,使結腸癌HT-29細胞變圓、皺縮、喪失細胞形態。有趣的是,我們觀察到LFUS和5-FU聯合處理組干細胞球體松散,且個體小,數量顯著減少,qRT-PCR和Western blot結果提示LFUS和5-FU聯合處理可顯著降低結腸癌干細胞的干性基因CD133、CD44和Sox2的表達水平。

腫瘤細胞受相關致癌基因的調控常常表現出抗凋亡的性質,影響細胞的正常代謝更新。研究者們[28]通過研究抗腫瘤療法/藥物是否能夠抑制甚至逆轉腫瘤細胞的抗調亡能力或者誘導腫瘤細胞的調亡來評估該療法/藥物在臨床中的應用前景。PARP是細胞凋亡核心成員半胱天冬酶(Caspase)的切割底物,對于細胞的穩定和存活非常重要,PARP失去酶活力會加速細胞的不穩定。另外,Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的編碼產物,Bcl-2能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質,從而抑制了細胞凋亡。通常,PARP剪切以及Bcl-2表達下調被認為是細胞凋亡的重要指標[29]。

本研究進一步經過流式細胞儀檢測發現經聯合處理的結腸癌干細胞凋亡率顯著增加,同時凋亡相關蛋白PARP和Bcl-2也出現了凋亡相應的變化,那么表明低頻超聲可以明顯增強5-FU誘導的結腸癌干細胞凋亡。但是本研究未對LFUS誘導細胞凋亡和影響腫瘤干細胞克隆形成能力降低的分子機制進行詳細的研究,LFUS的刺激是否抑制CSCs的自我更新能力并誘導腫瘤干細胞分化為普通癌細胞而增強了對5-FU的敏感性還需要進一步研究。值得指出的是,腫瘤干細胞的自我更新能力在腫瘤干細胞克隆形成、腫瘤侵襲轉移過程中起著重要作用,那么未來降低腫瘤干細胞的干性和侵襲能力,并增強其對化療藥物治療的敏感性,阻斷參與腫瘤干細胞自我更新和維持的通路對于抗腫瘤治療至關重要。

4 結論

綜上所述,本研究結果表明低頻超聲聯合5-FU可以顯著抑制結腸癌細胞活性,降低結腸癌干細胞的干性并促進其凋亡,從而增強結腸癌細胞對化療藥物的敏感性,這為結腸癌的臨床治療提供了另一種思路,也為低頻超聲聯合低劑量的化療藥進行抗腫瘤治療奠定研究基礎。