PD-1/PD-L1通過抑制穿孔素和顆粒酶的極化抑制Vδ2T細胞對結直腸癌細胞的殺傷作用

李啟鳳,李一凡,張金芳,王開昕

(1華中科技大學協和深圳醫院,深圳市南山區人民醫院病理科,深圳 518000;2華中科技大學協和深圳醫院,深圳市南山區人民醫院中心實驗室)

結直腸癌是全球僅次于肺癌和乳腺癌的第三大常見癌癥。據2018年全球統計數據顯示,全球2018年新發結直腸癌患者數占全球癌癥新發患者的10.2%,位居新發癌癥人數的第三位。結直腸癌死亡人數占全球癌癥死亡患者的9.2%,位居癌癥死亡人數的第二位[1]。結直腸癌的發生是一個復雜且異質性的過程,由多種發病因素相互作用引起,包括遺傳因素和環境因素,如飲食和生活方式等[2]。結直腸癌現有治療包括早期階段的手術治療,然后晚期患者需聯合化療和/或放療,給患者帶來嚴重的副作用[3]。

程序性細胞死亡分子-1(programmed cell death-1,PD-1)是一種免疫負調節分子,通過與其配體PD-L1的相互作用,對機體的免疫功能發揮抑制作用。PD-1/PD-L1分子在多種癌癥的發生和發展中具有重要的作用[4-8]。研究證實,腫瘤細胞及其相關的基質細胞可以表達PD-L1,這種PD-L1通過與腫瘤殺傷T細胞表面PD-1相互作用,不僅引起腫瘤細胞的免疫逃逸,還導致活化的T細胞凋亡,因此阻斷PD-1/PD-L1可以增加免疫細胞的抗腫瘤活性。目前,多種針對PD-1的單克隆抗體已被研發用于包括肺癌、肝癌和乳腺癌的治療[9-11]。既往研究表明,PD-L1在轉移性結直腸癌中的表達水平比在原發性腫瘤中普遍更高。近些年,PD-1/PD-L1也被確定為結直腸癌免疫治療的可能靶點[12]。

結直腸癌患者體內的殺傷性細胞除外傳統CD8 T細胞,Vδ2T細胞也是具有腫瘤殺傷活性的細胞[13]。Vδ2T細胞識別腫瘤相關抗原不具有MHC限制性,是一種天然免疫細胞。Vδ2T細胞的主要作用包括參與機體對腫瘤的免疫監視和對病原體侵襲的防御反應[14,15]。隨著30年前第一次提出Vδ2T細胞的概念[15],到目前隨著對Vδ2T細胞研究的深入,其已被證實對多種腫瘤細胞具有殺傷作用,是最具潛力的腫瘤過繼免疫治療細胞之一。然而目前,關于PD-1/PD-L1對Vδ2T細胞殺傷結直腸癌細胞的抑制作用及相關機制的探索目前還很少有研究報道。本文觀察了健康志愿者外周血擴增Vδ2T細胞對結直腸癌細胞的殺傷情況,探討PD-1對Vδ2T細胞殺傷功能的影響及相關機制,期望為未來結直腸癌患者PD-1單克隆抗體的免疫療法或Vδ2T細胞過繼免疫療法的應用提供一些科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.2 Vδ2T細胞擴增

為了擴增人Vδ2T細胞,首先使用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法從健康成人外周血分離獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBMC培養于含10% FBS和0.5 mmol/L唑來膦酸鹽的RPMI-1640培養基中。48 h后向培養基中加入重組人IL-2(終濃度50 IU/ml),并每3 d補充一次重組人IL-2。待培養至第14天時收集擴增的Vδ2T細胞,采用流式細胞儀分析純度,純度達到90%以上可用于后續實驗。

1.3 Vδ2T細胞殺傷功能檢測

1.4 結直腸癌細胞表面分子檢測

通過流式細胞術檢測結直腸癌細胞表面與Vδ2T細胞活化相關的配體和共刺激分子表達情況(ULBP-1-4、MICA、MICB、MSH2),以及活化抑制分子的表達情況(TIM-3、CTLA-4和PD-L1)。具體方法如下:HR8348和SW480細胞以臺盼藍染色計數后制備成濃度為2×106個/ml的細胞懸液。取100 μl上述細胞加入1.5 ml的eppendorf管中,加入1 ml含1% BSA的PBS洗滌液,充分混勻后250g離心8 min,棄上清,重復上述操作。隨后細胞以100 μl含1%BSA的PBS重懸,于液體中加入相應抗體,4 ℃避光孵育30 min;以含1%BSA的PBS洗滌2次后,細胞重懸于0.1 ml PBS中進行流式細胞儀檢測。

1.5 PD-L1阻斷

將SW480細胞分為兩組,一組為PD-L1阻斷組:加入97 μl PBS+3 μl PD-L1抗體;另一組為對照組:加入100 μl PBS。將兩組細胞分別與Vδ2T細胞共培養,用于后續研究。

1.6 Vδ2T細胞裂解性顆粒極化情況檢測

已知裂解性顆粒極化在Vδ2T細胞殺傷腫瘤細胞中具有重要的作用。本研究將通過Confocal方法檢測Vδ2T細胞裂解性顆粒極化情況。具體方法如下:將Vδ2T細胞和結直腸癌細胞SW480懸液稀釋至1×107cells/ml。取上述細胞各100 μl混勻,20g離心3 min使細胞可以充分接觸;離心后的細胞置于37 ℃,5% CO2孵箱中孵育20 min;隨后將細胞轉入poly-D-lysine包被的2孔細胞培養板(購自BD Biosciences)中,室溫孵育1 h;以無菌吸管吸去培養基,再用1 ml PBS洗2次;4%多聚甲醛1 ml室溫固定20 min;再用1 ml PBS洗2次;0.5 ml透化Buffer室溫處理細胞30 min;加入含3 μg/ml穿孔素抗體的染色Buffer室溫染色1 h;1 ml PBS洗3次,每次5 min;將片子于空氣中吹干;ProLong Gold Antifade Reagent封片。

1.7 PLC-γ1和Erk1/2信號通路活化情況檢測

通過Western blot方法檢測Vδ2T細胞內與裂解性顆粒極化相關信號通路的表達情況。具體方法如下:等量提取的Vδ2T細胞總蛋白經10% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠分離后,采用半干轉膜儀將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上,以含5% BSA的TBST室溫封閉1 h,加入pY783-PLC-γ1(1∶1 000)和p-Erk1/2抗體(1∶1 000),4 ℃過夜孵育。第2天用0.1% TBST洗膜3次,每次5 min,加入相應的HRP標記的二抗,室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜后,硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學發光底物對條帶進行顯色。actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Vδ2T細胞對結直腸癌細胞具有殺傷作用

殺傷結果顯示,Vδ2T細胞對結直腸癌細胞HR8348和SW480的殺傷效率存在差異(見圖1)。Vδ2T細胞對SW480細胞沒有顯著的殺傷作用,而對HR8348細胞的有一定的殺傷作用。

與效靶比為10∶1相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 結直腸癌細胞表面Vδ2T細胞功能活化和抑制相關分子的比較

流式細胞染色結果顯示,Vδ2T細胞活化配體和共刺激分子ULBP-1-4、MICA、MICB和MSH2在HR8348和SW480細胞的表達并不存在顯著差異(見圖2)。HR8348和SW480細胞表面Vδ2T細胞活化抑制分子的表達檢測結果顯示HR8348和SW480細胞表面表達CTLA-4和TIM-3并不存在顯著差異;而二者的PD-L1表達水平存在顯著差異,SW480細胞具有顯著更高的PD-L1表達水平(P<0.01,見圖2)。

灰色實體峰為同型對照抗體染色結果,紅線峰為HR8348細胞染色結果,藍線峰為SW480細胞染色結果;與HR8348細胞相比,**P<0.01

2.3 阻斷PD-L1后Vδ2T細胞對結直腸癌細胞的細胞毒作用

采用PD-L1封閉抗體封閉SW480細胞表面PD-L1后,結果顯示Vδ2T細胞對SW480細胞的殺傷能力顯著增強(P<0.01)。同時,封閉HR8348表面PD-L1作用后,Vδ2T細胞HR8348細胞的殺傷能力也出現明顯升高(P<0.01,見圖3)。

與對照組相比,**P<0.01

2.4 阻斷PD-L1后Vδ2T細胞裂解性顆粒極化情況

Confocal結果顯示,在阻斷PD-L1后SW480細胞引起Vδ2T細胞裂解性顆粒極化的水平顯著升高(P<0.01,見圖4)。

圖4 阻斷PD-L1后Vδ2T細胞裂解性顆粒極化情況

2.5 阻斷PD-L1后Vδ2T細胞裂解性顆粒極化相關信號通路活化情況

Vδ2T細胞裂解性顆粒極化相關信號通路包括PLC-γ1和Erk1/2。本研究通過Western blot方法檢測在阻斷PD-L1后SW480細胞引起Vδ2T細胞PLC-γ1和Erk1/2磷酸化活化的情況。以阻斷開始時的對照組相對熒光強度為1,計算各組相對熒光強度,結果顯示,阻斷PD-L1后的5 min和10 min,SW480細胞引起Vδ2T細胞PLC-γ1和Erk1/2磷酸化活化的水平顯著升高(P<0.01，見圖5)。

同時間與對照組相比,**P<0.01

3 討論

惡性腫瘤通過激活免疫檢查點從而創造免疫抑制的腫瘤微環境。在所研究的免疫檢查點中,程序性細胞死亡分子-1(programmed cell death-1,PD-1)和PD-1的配體(PD-L1)是目前的研究熱點。PD-1和PD-L1之間的特異性結合可抑制T細胞產生IL-2,并誘導T凋亡增加[16]。因此阻斷PD-1/PD-L1可以增加免疫細胞的抗腫瘤活性。多種針對PD-1的單克隆抗體已被研發用于包括肺癌、肝癌和乳腺癌的治療[9-11]。目前,PD-1抑制劑在多種腫瘤的治療以聯合治療為主,單獨的PD-1抑制劑療效有限。臨床可用的聯合治療包括化療、放療或是小分子抑制劑等[17-19]。腫瘤過繼免疫治療目前也處于研發狀態,主要是把致敏淋巴細胞(具有特異免疫力的)或致敏淋巴細胞的產物(例如轉移因子和免疫核糖核酸等)輸給腫瘤病人,使其獲得抗腫瘤免疫力。既然PD-1抑制劑的主要作用是解除殺傷性T細胞的免疫抑制,在此基礎上如聯合過繼免疫治療從理論上來說是可以進一步增加抗腫瘤活性的,但是目前臨床還未見研究進展。本研究從理論基礎上對PD-1抑制Vδ2T細胞殺傷功能及相關機制進行研究,期望可以為未來結直腸癌患者PD-1單克隆抗體的免疫療法或Vδ2T細胞過繼免疫療法的應用提供一些科學依據。

本研究結果顯示,Vδ2T細胞對結直腸癌細胞HR8348和SW480細胞的殺傷效率存在差異。Vδ2T細胞對SW480細胞的殺傷作用很微弱,而對HR8348細胞有較強的殺傷作用。流式細胞術結果顯示,HR 8348和SW480細胞表面表達的和Vδ2T細胞活化相關的配體,包括ULBP-1-4、MICA、MICB和MSH2在HR8348和SW480細胞的表達并不存在顯著差異;此外,HR8348和SW480細胞表面表達的Vδ2T細胞活化抑制分子CTLA-4和TIM-3也并不存在顯著差異;而二者的PD-L1表達水平存在顯著差異,SW480細胞具有顯著更高的PD-L1表達水平(P<0.01)。提示,PD-L1表達水平的差異可能是Vδ2T細胞對HR8348和SW480細胞的殺傷效率存在差異的原因。

本研究進一步對PD-L1對Vδ2 T細胞殺傷功能的抑制作用進行驗證。封閉PD-L1作用后,Vδ2 T細胞對SW480細胞的殺傷能力顯著增強(P<0.01)。同時,封閉HR8348表面PD-L1作用后,Vδ2 T細胞HR8348細胞的殺傷能力也出現明顯升高(P<0.01)。初步提示,PD-1和PD-L1的相互作用是抑制Vδ2 T細胞對結直腸癌細胞殺傷的主要原因。同時本研究還發現在封閉SW480細胞表面PD-L1后,Vδ2T細胞裂解性顆粒的極化能力顯著提高。已知Vδ2T細胞的殺傷功能主要依賴于穿孔素-顆粒酶途徑,且主要受裂解性顆粒極化的影響[21]。上述結果初步提示PD-1和PD-L1抑制Vδ2T細胞對結直腸癌細胞殺傷功能主要是通過抑制Vδ2T細胞穿孔素-顆粒酶極化而發揮的。已知殺傷性細胞裂解性顆粒極化與PLC-γ1和Erk1/2磷酸化水平相關[20,21]。本研究發現,封閉SW480細胞表面PD-L1后,Vδ2T細胞內與裂解性顆粒極化相關的PLC-γ1和Erk1/2磷酸化水平均顯著增強(P<0.01)。

綜上所述,本研究初步證實,Vδ2T細胞對不同結直腸癌細胞的殺傷作用是存在差異的,這種差異主要是腫瘤細胞表面PD-L1分子表達的不同所引起的;進一步的機制研究表明,PD-1抑制Vδ2T細胞的殺傷作用主要通過抑制裂解性顆粒極化及PLC-γ1和Erk1/2磷酸化活化而實現,為闡明PD-1抑制Vδ2T細胞殺傷結直腸癌細胞的作用機制提供了一定的證據支持。