基于網絡藥理學分析當歸活血湯治療下肢動脈硬化閉塞癥的作用機制

王繼雪 袁星星 于文慧 呂勃川 趙鋼

摘要 目的：分析當歸活血湯治療下肢動脈硬化閉塞癥的有效活性成分及靶點的藥理作用。方法：通過中藥系統藥理數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選當歸活血湯有效活性成分及靶點，運用GeneCard及OMIM數據庫獲取下肢動脈硬化閉塞癥（ASO）相關蛋白;通過String平臺對藥物-疾病靶蛋白進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建，利用DAVID數據庫，將所得到的當歸活血湯-下肢ASO靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：當歸活血湯藥物有效活性成分234個，當歸活血湯-下肢ASO作用靶點共26個;PPI網絡分析結果發現IL-6、VEGFA、MMP-9、IL-10等可能是當歸活血湯治療ASO的關鍵靶點。共獲得46條GO生物過程和167條相關信號通路，其中HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路與下肢ASO的治療密切相關。結論：基于網絡藥理學探究當歸活血湯主要成分的靶點網絡及其治療下肢ASO的作用機制，為進一步對本病的基礎實驗研究提供新思路及科學依據。

關鍵詞 當歸活血湯;下肢動脈硬化閉塞癥;靶點;作用機制;網絡藥理學

Mechanism of Danggui Huoxue Decoction in the Treatment of Arteriosclerosis Obliterans of the Lower Extremities Based on Network Pharmacology

WANG Jixue1，YUAN Xingxing1，2，YU Wenhui3，LYU Bochuan3，ZHAO Gang3

（1 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150006，China; 3 Department of Peripheral Vascular Diseases，the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective：To analyze the active components of Danggui Huoxue Decoction in the treatment of arteriosclerosis obliterans（ASO） of the lower extremities and the pharmacological effect of its target.Methods：By TCMSP database，we screened the effective active ingredients and targets of Danggui Huoxue Decoction and we used GeneCard and OMIM database to obtain lower limb ASO-related proteins; we used String platform to construct PPI network for drug-disease target proteins，and used DAVID database to obtain Danggui Huoxue Decoction-lower ASO target for GO function and KEGG pathway enrichment analysis.Results：Danggui Huoxue Decoction had 234 active ingredients，and Danggui Huoxue Decoction-lower limb ASO had 26 targets; In PPI interaction network analysis it was found that IL-6，VEGFA，MMP-9，IL-10，etc.may be the treatment of Danggui Huoxue Decoction for the key target of ASO.A total of 46 GO biological processes and 167 related signal pathways were obtained，of which HIF-1，AGE-RAGE，IL-17，TNF and other signal pathways were closely related to the treatment of lower extremity ASO.Conclusion：Based on network pharmacology，the target network of the main components of Danggui Huoxue Decoction and its mechanism of action in the treatment of lower limb ASO are explored，which provides new ideas and scientific basis for further basic experimental research on this disease.

Keywords Dangguihuoxue Decoction; Lower extremity arteriosclerosis obliterans; Target; Mechanism of action; Network pharmacology

中圖分類號：R211;R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.010

下肢動脈硬化閉塞癥（Arteriosclerosis Obliterans，ASO）是外周血管疾病中最常見的一種因動脈硬化斑塊所致的下肢動脈閉塞性疾病。間歇性跛行是臨床早期出現的典型癥狀，隨著病情加重逐漸發展為靜息痛、嚴重者局部缺血部位出現大范圍皮膚潰爛[1]。隨著經濟水平的不斷增長，生命質量的不斷提高，人口老齡化現象日益加劇，下肢ASO的發病率呈現逐年上升的趨勢[2]。據不完全統計，目前我國約有2 000萬人罹患本病，以老年男性者居多。研究顯示，70歲以上人群中發病率約為20%，而在70歲以下人群中則為3%～10%[3-4]。截至2010年，全球罹患下肢ASO的患者高達2.02億。隨著糖尿病、吸煙、高血壓、高脂血癥等高風險因素發病率的不斷上升[5]，使下肢ASO成為世界范圍內備受關注的健康問題[6]。

當歸活血湯最早見于明·《傷寒六書》，主要功效為活血化瘀。經后世醫家辨病化裁，成為治療不同疾病的經典方劑，分別記載于《眼科全書》《癥因脈治》《醫方考》等古籍中。目前，由當歸、赤芍、川芎、丹參、黃芪、雞血藤、甘草組成的當歸活血湯多用于治療中醫脫疽病。機制研究方面，當歸活血湯具有抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化應激、改善下肢微循環等藥理作用[7]，目前其治療下肢ASO的藥效研究尚處于基礎的臨床觀察階段[8-9]，網絡藥理學作為新興的中藥研究方法，可對中藥多成分、多靶點進行整體研究，挖掘其潛在的作用機制。現基于網絡藥理學，探究當歸活血湯治療下肢ASO的作用機制。

1 材料與方法

1.1 當歸活血湯活性成分篩選

基于中藥系統藥理數據庫與分析平臺（TCMSP），以“當歸”“赤芍”“丹參”“黃芪”“川芎”“雞血藤”“甘草”為檢索詞，選取當歸活血湯中所含中藥的化合成分。以口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，過濾獲取每味中藥的化合成分及對應的藥物靶點。

1.2 藥物-疾病靶點網絡可視化分析

利用GeneCard及OMIM數據庫以“Arteriosclerosis occlusion”為檢索詞，收集下肢ASO靶點。運用Interactivenn平臺上（http：//www.interactivenn.net/）將藥物活性成分-疾病共同蛋白進行提取，所得交集即為Drug-Disease靶點。通過Cytoscape 3.7.1軟件對Drug-Disease進行可視化網絡分析。

1.3 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡

將Drug-Disease結果傳至String平臺進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析。設定物種為“Homo sapiens”，設定最低互動分數為0.400[10]。運用Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化分析。

1.4 GO功能及KEGG富集分析

將Drug-Disease結果輸入至DAVID數據庫進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，分別通過OmicShare平臺（http：//www.omicshare.com/）和Cytoscape 3.7.1軟件對GO和KEGG富集分析結果進行可視化。

2 結果

2.1 當歸活血湯活性成分的篩選

共檢索得到當歸活血湯所有活性成分234個，根據OB值將各藥物排名前5的有效活性成分基本信息見表1。

2.2 藥物-疾病靶點（Drug Disease Target，DDT）網絡構建及可視化

共得到當歸活血湯中146個藥物靶點，通過GeneCard，OMIM上檢索到關于下肢動脈硬化閉塞癥的617個靶點，將二者進行交集處理，共得到26個藥物疾病靶點。見圖1。利用Cytoscape 3.7.1軟件對DDT進行網絡可視化。見圖2。

2.3 PPI網絡的構建及可視化

通過String平臺對得到的26個藥物疾病靶點進行PPI網絡構建，然后利用Cytoscape軟件對PPI結果行網絡可視化分析。PPI網絡最終得到共包含26個節點，208條邊。根據Degree值對節點進行排序，排名前5的靶點為IL-6、VEGFA、MMP-9、IL-10、MMP-2。見圖3。

2.4 GO富集分析

將所得到的26個藥物疾病靶點，通過DAVID數據庫進行GO功能富集分析，共得到46條功能注釋。通過OmicShare平臺對BP、MF和分子功能排名，根據P值和富集靶點數靠前的GO富集分析結果進行排序。見圖4，表2。

2.5 KEGG富集分析

通過DAVID平臺對26個DDT進行KEGG富集分析，共得到167條富集通路，富集排名靠前的通路主要有HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路密切相關。見圖5，表3。通過Cytoscape 3.7.1軟件對DDT與富集通路進行可視化網絡。見圖6。

3 討論

下肢ASO是全身動脈硬化在肢體的局部表現。動脈粥樣硬化的病因尚不明確，醫學界普遍認為其發病機制與血栓形成、脂質浸潤、內膜損傷、炎癥反應、免疫反應、氧化應激、血管平滑肌細胞激活等有關。目前，越來越多的研究證實炎癥反應在ASO過程中扮演重要角色，這也是現階段下肢ASO研究的重要切入點之一。通過對當歸活血湯治療下肢ASO的成分-靶點進行網絡分析發現，本方中所含藥物包括多種化學成分，且不同成分可以作用于多個靶點，充分體現中藥組方多成分、多靶點相互協同作用。

本研究通過收集、篩選當歸活血湯中所含藥物，共得到234個活性成分，主要有芒柄花素、川芎哚、丹參酮ⅡA等能夠預防及延緩ASO的形成。現代藥理研究發現，芒柄花素具有降脂、抗脂質過氧化，改善AS病變[11];此外，芒柄花素還能夠抑制平滑肌細胞增殖及遷移。趙培等[12]通過研究芒柄花素上調SR-BI蛋白表達，抑制主動脈壁泡沫細胞形成及平滑肌細胞增殖，達到預防和延緩ASO的形成和發展。血小板聚集和血栓形成是ASO形成的主要病理基礎。唐剛華等[13]研究發現川芎哚（川芎Ⅲ號堿）具有抗凝、降低全血黏度及紅細胞聚集、改善血液流變學及輕度增強紅細胞變形的作用，尋找抗血小板聚集和抗血栓形成的藥物對于防治ASO意義重大[14]。符杰等[15]研究表明丹參酮ⅡA可通過減少大鼠主動脈內皮細胞分泌ADMA，抑制eNOS降解，促進NO分泌，達到抑制血管收縮，預防ASO形成。進一步對活性成分靶點進行預測，得出146個對應的潛在靶點，通過檢索相關數據庫共獲得與下肢ASO疾病相關的靶點617個，利用VENNY網絡篩選出當歸活血湯與下肢ASO共同作用靶點26個，體現了當歸活血湯的整體協同作用。

PPI網絡分析顯示，當歸活血湯中藥物作用的靶蛋白與下肢ASO的作用靶蛋白，二者之間存在復雜的作用關系。通過IL-6、STAT3、VEGFA、MMP-9、IL-10、MMP-2，炎癥介質、血管生長因子、黏附分子、多種酶等靶點相互作用，起到抗動脈硬化的作用。諸多研究提示斑塊內活動性炎癥與斑塊的穩定性相關[16]。IL-6是一種具有廣泛生物學效應的炎癥介質，尤其在纖維帽及粥樣斑塊高表達水平，參與ASO及斑塊破裂的全過程，通過與受體結合可誘導STAT3的活化。盧素宏等[17]研究證實，IL-6可激活IL-6/STAT3信號通路傳導，介導組織炎癥和細胞增殖。ICAM-1、VCAM-1等黏附分子參與AS慢性炎癥反應全過程，聚集反應增強，在影響斑塊形成的同時還影響斑塊穩定性。IL-6還可以刺激基質金屬蛋白酶（MMP），其升高分解了EMC的核心物質膠原纖維，使纖維帽變薄，誘導動脈斑塊破裂。故認為MMPs的增多可嚴重影響斑塊穩定性。MMP-2和MMP-9同屬于基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）家族成員，在Endothelin-1、IL-1β、Ang-Ⅱ、TNF-α、缺氧等因素的誘導下，明膠酶MMP-2和MMP-9不斷上調，酶解ECM中的Ⅳ型膠原，致其組織形態發生改變[18]。哈略和趙百孝[19]通過積極干預降低主動脈內MMP9含量，達到促進斑塊穩定性的效果[20]。此外，MMP-2能夠加速細胞外基質降解，在斑塊形成后促進平滑肌細胞增殖和遷移，有利于單核巨噬細胞、平滑肌細胞及淋巴細胞向內膜下遷移，增加ASO斑塊的易損性[21-22]。而IL-10是一種多效單鏈糖蛋白，其抗炎機制在ASO斑塊的形成和穩定中起到保護作用[23]，IL-10較IL-4突出的一點即其可通過抑制核因子κB發揮抗炎機制，但其抗凋亡機制是否起到穩定AS斑塊的作用尚有爭議。同樣，動脈內皮細胞的損傷和功能失調也參與ASO發生發展，秦臻和黃水清[24]研究發現，當歸補血湯可通過促進內皮受損后VEGF及SDF-1的釋放，誘導EPCs增殖，VEGF可使受損缺血部分EPCs大量聚集，促進血管新生。黃水清等[25]通過調控與炎癥介質關系密切的核因子κB及P38MAPK通路保護內皮細胞。以上靶蛋白的相互協同作用、可能是當歸活血湯治療下肢ASO的主要作用機制。

我們對當歸活血湯治療下肢ASO進行GO富集分析發現，當歸活血湯通過多靶點、多結構、多形式參與生物學進程，主要涉及細胞增殖、轉錄因子活性、抗氧化活性等，與下肢ASO發生發展過程中的炎癥反應[26]、免疫反應[27]、氧化應激損傷[28]等相互作用，驗證出網絡藥理學的合理性和可靠性。KEGG通路分析結果顯示，當歸活血湯治療下肢ASO主要涉及HIF-1、AGE-RAGE、IL-17等與炎癥、氧化應激相關的通路，本研究發現IL-6、VEGFA、STAT3等基因主要富集在HIF-1信號通路，HIF-1作為機體微環境缺氧的關鍵轉錄調控因子，在缺血缺氧的條件下，HIF-1合成增加，并通過VEGF、Ang-Ⅱ合成等方式促進血管形成。IL-6、VEGFA、VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、STAT3等主要富集于AGE-RAGE信號通路上，RAGE是導致ASO發生的重要膜受體[29]。AGEs和受體相互作用，可引起氧化應激等反應，導致血管通透性增加、管壁增厚、脂質蛋白沉積，并可導致動脈粥樣硬化。郭曉華等[30]實驗證明AGE可通過與RAGE結合引發氧化應激，引起細胞內信號轉導，導致內皮細胞通透性增高。莫中成等[31]發現AGEs誘導內皮細胞表達VCAM-1和ICAM-1，可能是其促動脈粥樣硬化發生發展的一個重要機制。AGE與RAGE結合，可誘導內皮細胞發生氧化應激。MMP9、IL-6、IL-4主要富集于IL-17信號通路，國外研究發現IL-17A在炎癥發生過程中起著重要作用[32]。研究認為IL-17A的增多促進下肢ASO的發生和發展[33]，但Danzaki等[34]通過對ApoE-/-小鼠實驗發現認為IL-17A表達水平的缺陷是促進動脈粥樣斑塊進展的主要誘因和條件。IL-6、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1等均富集于TNF信號通路，TNF-α作為一種強效炎癥介質，參與多種細胞行為。TNF-α由單核-巨噬細胞產生后直接作用于內皮細胞，并通過多重路徑誘導細胞損傷，促進平滑肌細胞增殖、遷移和凋亡，影響ASO斑塊的穩定性。付建玉[35]在研究TNF-α的缺失對小鼠AS的影響發現，TNF-α的缺失會降低血脂水平，使炎癥反應減輕，延緩ASO的形成與發展[36]。再次說明多生物途徑、多信號通路相互協同作用是當歸活血湯治療下肢ASO主要的機制研究基礎。

4 結論

當歸活血湯通過234個活性成分作用于26個靶點，167條信號通路，主要通過抗炎、抗氧化應激、抑制平滑肌細胞的增殖、降解細胞外基質等途徑，穩定ASO斑塊、保護內膜等協同作用來治療下肢ASO，為深入探討當歸活血湯治療下肢ASO的效應機制提供基礎。

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（2020-07-01收稿 責任編輯：楊覺雄）