基于網絡藥理學的補中益氣丸抗疲勞機制研究

劉心悅 崔潔 賀超 王文全

摘要 目的：探討補中益氣丸發揮抗疲勞作用的主要活性成分和潛在的機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選補中益氣丸中的活性成分，利用Swiss Target Prediction、Drugbank、Cytoscape 3.7.1、R語言等數據庫及軟件預測活性成分作用靶點和“疲勞”相關靶點、構建疾病-藥物-有效成分-靶基因的互作網絡和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并進行關鍵靶基因的基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，最后通過設計動物實驗探究補中益氣丸的抗疲勞藥效。結果：分析表明與補中益氣丸抗疲勞相關的163個潛在活性成分作用于與疲勞相關的108個靶點和160條通路。進一步網絡特征分析發現表現主要活性成分為黃酮類和甾醇類化合物，通過參與脂多糖應答、對原細菌分子的反應等生物過程，調控MAPK、PI3K-AKT、TNF等信號通路進而發揮抗疲勞作用。藥效學試驗結果提示補中益氣丸可顯著增強小鼠運動耐力，但無顯著緩解體力疲勞的效果。結論：補中益氣丸具有多成分-多靶點-多途徑的抗疲勞特點，其活性成分作用于多個靶點蛋白，調控多個生物過程及信號通路，起到改善機體氧化應激反應，調控細胞功能等作用，但在調節機體能量代謝方面未有明顯的富集效果及藥效學試驗結果。本研究為進一步開發抗疲勞功能產品及藥品和臨床應用提供理論指導，為探究補中益氣丸抗疲勞作用機制提供新思路。

關鍵詞 補中益氣丸;抗疲勞;網絡藥理學;作用機制

Mechanism of Anti-fatigue of Buzhong Yiqi Pills Based on Network Pharmacology

LIU Xinyue1，CUI Jie1，HE Chao1，WANG Wenquan 1，2，3

（1 Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China; 2 School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China; 3 Engineering Research Center of Good Agricultural Practice for Chinese Crude Drugs，Ministry of Education，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To explore the main active components and potential mechanism of Buzhong Yiqi Pills in anti-fatigue.Methods：The potential active components in Buzhong Yiqi Pills were screened according to TCMSP database.Swiss target Prediction，drugbank，Cytoscape 3.7.1，R language and other databases and softwares were used to predict the target of active ingredients and fatigue related targets，to construct the interaction network of disease-drug-active-ingredients target genes and PPI network of protein interaction，and to carry out enrichment analysis of GO and KEGG of key target genes.Finally，animal experiments were designed to explore the anti-fatigue effect of Buzhong Yiqi Pills.Results：The results showed that 163 potential active components related to Buzhong Yiqi Pills could act on 108 targets and 160 pathways related to fatigue.Further analysis of the network characteristics showed that the main active components were flavonoids and sterols，which regulated MAPK，PI3K AKT，TNF and other signaling pathways through participating in lipopolysaccharide response，the reaction of source bacterial molecules and other biological processes，thus playing an anti-fatigue role.The results of pharmacodynamics test showed that Buzhong Yiqi Pills could significantly enhance the exercise endurance of mice，but had no significant effect on relieving physical fatigue.Conclusion：Buzhong Yiqi Pills gets the anti-fatigue characteristics of multi-component，multi-target and multi-channel.Its active components can regulate multiple biological processes and signal pathways by interacting with multiple target proteins，which can improve the body′s oxidative stress response and regulate cell function.However，it has no obvious enrichment effect and pharmacodynamic results in regulating the body′s energy metabolism.This study provides theoretical guidance for the further development of anti-fatigue functional products and drugs and clinical application，and provides new ideas for exploring the anti-fatigue mechanism of Buzhong Yiqi Pills.

Keywords Buzhong Yiqi Pills; Anti-fatigue; Network pharmacology; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.008

疲勞是一種涉及多重復雜因素的主觀意識，按照屬性可分為生理性疲勞和病理性疲勞，前者通常發生在強烈的體力勞動之后，往往是一個機體自我保護信號，建議身體休息。而后者癥狀不會隨著休息而緩解，如癌因性疲勞、免疫系統介導的病毒感染性疲勞、慢性和精神疾病如多發性硬化癥、肺結核、帕金森病、艾滋病、腦卒中、慢性阻塞性肺疾病和精神分裂癥等伴隨的疲勞[1-6]。病理性疲勞感更強烈，持續時間更長，會對個體的功能活動和生命質量造成嚴重損害。研究表明，疲勞的發生機制主要涉及能量代謝，氧化應激、代謝產物累積、免疫系統紊亂、內分泌系統失調等[7]。

補中益氣丸出自《脾胃論》，為益氣健脾的代表方劑，由黃芪（蜜炙）、黨參、甘草（蜜炙）、白術（炒）、當歸、升麻、柴胡、陳皮組成，具有補中益氣，升陽舉陷的功效[8]。中醫認為氣為人生命活動的根本，李東垣在《脾胃論·脾胃虛實傳變論》中言道“元氣之充足，皆由脾胃之氣無所傷，而后能滋養元氣”，脾胃的作用為運化水谷精微，布輸全身，維持正常的生命活動。現代藥理學研究表明補中益氣丸具有促進胃腸蠕動、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[9-12]。補中益氣丸的抗疲勞效果也已被初步證實，研究發現補中益氣丸可有效緩解癌因性疲勞（Cancer-related Fatigue，CRF）[13-14]，并且能改善急性運動后大鼠腦組織呼吸鏈復合體Ⅱ、Ⅲ及ATP酶活性，對線粒體氧化磷酸化有一定的保護作用，可顯著降低運動后大鼠血清丙二醛（MDA）含量，提高谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，從而提高機體抗疲勞能力[15-17]，楊可文等[18]觀察到大劑量補中益氣湯治療運動疲勞的臨床有效率為96.87%，且無不良反應。

網絡藥理學從整體和系統的角度探索藥物與疾病的關系，這與中醫的整體特征非常一致[19]，以系統生物學和多重藥理學理論為基礎，利用網絡可視化和網絡分析技術揭示藥物、有效成分、靶點和疾病之間復雜的生物網絡關系，以期預測藥理作用機制[20]。關于補中益氣丸抗疲勞機制系統、深入的研究尚未見報道，因此本研究擬通過網絡藥理學的方法，闡釋其潛在作用機制，為相關功能產品及藥品的開發和臨床應用提供理論參考，為探究其抗疲勞作用機制提供新思路，本研究方法路線圖。見圖1。

1 資料與方法

1.1 藥物有效活性成分及對應靶基因的獲取

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索，根據ADME參數設置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為過濾標準，分別搜集補中益氣丸中8種中藥的主要活性成分。利用Swiss Target Prediction數據庫篩選出活性成分對應靶標;并利用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）將靶標名稱進行統一注釋，獲得有效成分靶基因集，該數據庫可集中、準確捕獲基因資源信息。

1.2 疾病（疲勞）靶基因集的建立

在DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）以及DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）中以“fatigue”“anti-fatigue”為關鍵詞進行檢索，查找與疲勞有關的靶標并進行整合去重，獲得疲勞靶基因集。

1.3 疾病-藥物-活性成分-靶點網絡的構建

利用TBTools得到補中益氣丸有效成分靶基因集與疲勞靶基因集的交集靶點并制作韋恩圖，將共有基因作為候選預測靶標，創建“藥物-成分-靶點”及“疾病-靶點”關系文件及屬性文件，導入Cytoscape 3.7.1軟件中進行可視化操作，形成疾病-藥物-藥物成分-靶點的作用網絡，并對數據進行拓撲分析。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將“補中益氣丸”與“疲勞”的共同作用靶點導入STRING數據庫（https：//string-bd.org/）中，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，隱藏網絡中無聯系的節點，其余參數不變，并根據蛋白之間的關聯度進行排序。獲取靶點相互作用的網絡關系數據，將其導入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制PPI網絡圖。

1.5 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

在R語言4.0.2程序中安裝“Bioconductor”軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將藥物-疾病共同靶點轉換成Entrez Gene ID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據已轉換的Entrez Gene ID，以P<0.05，Q<0.05進行關鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析，按照顯著性大小進行排序，選取前20條通路繪制氣泡圖。

1.6 補中益氣丸抗疲勞藥效學評價

本研究在北京協和醫學院藥用植物研究所實驗動物中心SPF級環境下飼養8周齡SPF級BABL/C雄性小鼠，體質量為（20.0±2.0）g，共計24只（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司），使其自由進水進食，適應性喂養一周后分為2組，每組12只，空白組每天灌胃蒸餾水，補中益氣丸組將補中益氣丸（國藥準字Z36021765）進行超聲溶解于蒸餾水后再進行灌胃，灌胃量為10 mL/（kg·d）。30 d后小鼠進行負重力竭游泳試驗：將尾部負重5%體質量鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳，記錄小鼠自游泳開始至力竭而沉入水中并維持8 s不能浮出水面的時間，并馬上把小鼠撈出水面[21]。而后繼續灌胃3 d，進行血清尿素氮（BUN）測定：末次給受試樣品30 min后，不負重游泳90 min，休息60 min后進行眼眶采血，取血清備用，利用全自動生化儀（貝克曼庫爾特au480）及血清尿素氮試劑盒（購自中生北控生物科技股份有限公司，批號190971）進行BUN含量檢測[22]。在灌胃38 d時，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟制備肝組織勻漿，按照肝糖原酶聯免疫試劑盒（購自上海酶聯生物科技公司）說明書測定肝糖原含量。

本研究由北京協和醫學院藥用植物研究所實驗動物中心倫理委員會批準通過（倫理審查號：SLXD-20190826005）。

1.7 數據分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，符合正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，方差齊性則2組間比較采用獨立樣本t檢驗，置信區間設置為95%，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物有效活性成分及對應靶基因的獲取

補中益氣丸所涉及的八味中藥中黃芪（包括20種化合物）、黨參（包括21種化合物）、甘草（包括92種化合物）、白術（包括7種化合物）、當歸（包括2種化合物）、升麻（包括17種化合物）、柴胡（包括17種化合物）、陳皮（包括5種化合物）的有效成分在整合并去重后共計163種，其中部分有效成分的信息見表1。

2.2 疾病-藥物-活性成分-靶基因網絡圖

為了研究補中益氣丸對疲勞的調控作用，需要對其中涉及的活性成分進行疲勞-多成分-多基因分析。首先通過Drugbank、GeneCards、DisGeNET數據庫以“Fatigue”“Anti-Fatigue”為關鍵詞進行檢索，獲得與疲勞相關的作用靶點1 226個。通過韋恩圖獲取補中益氣丸活性成分與疲勞交集基因108個。見圖2。將“疲勞”、補中益氣丸中的8味中藥及其活性成分、核心靶標錄入Cytoscape 3.7.1軟件中，構建疲勞-藥物-活性成分-靶基因PPI網絡圖。見圖3。網絡圖包含節點235個，邊線1 110條。見圖3。

依據軟件中導出的default node.csv文件，發現與抗疲勞相關的163種活性成分中，度值排名前10位的活性成分具體信息及拓撲性質見表2，其化學結構見圖4。將交集靶標錄入STRING數據庫，獲取蛋白相互作用關系并導出tsv文件。探索蛋白質相互作用（Protein-Protein Interactions）和相互作用網絡對于理解細胞組織、生物過程和功能非常重要，蛋白質常通過PPI執行特定的生物功能[23]。利用Cytoscape 3.7.1軟件構建出蛋白互作PPI網絡圖（圖5），其中排名10位的關鍵靶點（degree>20）拓撲信息見表3。

2.3 GO和KEGG的富集結果

通過GO功能富集分析，補中益氣丸八味中藥中與抗疲勞相關的潛在關鍵靶點基因共涉及生物過程（Biological Process，BP）富集條目2 109個，排名前5條的是脂多糖應答（Response to Lipopolysaccharide，34個基因）、對源細菌分子的反應（Response to Molecule of Bacterial Origin，34個基因）、抗生素響應（Response to Antibiotic，31個基因）、化學應激反應（Cellular Response to Chemical Stress，29個基因）和活性氧代謝過程（Reactive Oxygen Species Metabolic Process，27個基因），得到細胞組分（Cell Component，CC）條目59個，前三條是膜筏（Membrane Raft，22個基因）、膜微區（Membrane Microdomain，22個基因）、膜區（Membrane Region，22個基因），得到分子功能（Molecular Function，MF）條目137個（P<0.05），主要富集在細胞因子受體結合（Cytokine Receptor Binding，17個基因）、細胞因子活性（Cytokine Activity，15個基因）、磷酸酶結合（Phosphatase Binding，14個基因）、蛋白磷酸酶結合（Protein Phosphatase Binding，12個基因）等。取各類別排名前20的GO條目繪制氣泡圖見圖6。

KEGG通路富集得到160條（P<0.05），主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、卡波濟氏肉瘤皰疹病毒感染、TNF信號通路等通路、內分泌抵抗、MAPK、PI3K-AKT、AMPK信號通路等。見圖6。說明補中益氣丸主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝通路，多成分、多靶點相互調節。表4為部分通路的網絡特征，圖6為GO功能和KEGG途徑富集分析前20位結果：y軸顯示靶基因的GO和KEGG途徑顯著富集，x軸顯示基因比率。基因比率表示屬于GO或KEGG途徑的靶基因數量與所有注釋基因數量的比例。基因比例越高，富集程度越高。粒徑越大，GO或KEGG途徑中靶基因的數量越多，紅點越深，P值越小，代表與補中益氣丸干預疲勞關系越密切。

2.4 動物試驗結果

與空白組比較，補中益氣丸組的小鼠力竭游泳時間顯著延長，延長率為30.63%，肝糖原含量增加了4.7%，血清尿素氮含量沒有降低，后2個指標均無顯著性差異，提示補中益氣丸可顯著增強小鼠運動耐力，但對于調節機體能量代謝方面無明顯作用，分析可能原因是給藥劑量過小。見表5。

3 討論

氧化應激是疲勞的產生機制之一，氧化應激是指活性氧（ROS）的產生與機體抗氧化防御系統能力之間的不平衡，ROS是造成肌肉疲勞的主要原因。而排名前10位的核心有效成分中有9種都是黃酮類物質，黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，不僅能清除ROS或減少ROS形成，還可通過調節免疫系統提高機體耐受能力，減緩肌肉的損傷及能量的過度損耗，達到抗疲勞作用[24-25]。Lv等[26]發現甘草查爾酮A對對乙酰氨基酚（APAP）誘導的肝損傷具有保護作用，這可能與Nrf2介導的抗氧化防御機制密切相關。在中度氧化損傷中，槲皮素可減少ROS的產生，并激活PI3K-AKT和ERK1/2信號通路促進神經元的成活[27]。此外，槲皮素還能引起雙相、劑量依賴性效應，在低濃度下，起到抗氧化劑的作用，但在高濃度下作為一種促氧化劑發揮作用，可能會用于化療[28]。研究表明激活PI3K-AKT信號通路可抑制活性氧誘導的細胞損傷[29]，作為重要的抗氧化通路，它是本KEGG富集結果中值得關注的通路之一。PI3K-AKT信號通路是由一系列酶聯受體介導的信號轉導通路，不僅參與多種生長因子、細胞因子和細胞外基質等信號的轉導，同時還參與細胞凋亡、成活以及調控細胞糖代謝等多種細胞功能的調節[30-31]。另外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路亦在機體對環境應激適應及維持機體內氧化抗氧化動態平衡狀態中發揮著重要的作用[32]。在度值排名前10位的核心靶點之中有4個屬于MAPK家族，可見其調節機體疲勞的重要性。MAPK信號通路是由一系列連續作用的激酶組成，其中細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）是MAPK級聯的主要組成部分，負責在細胞膜上傳遞生長因子信號，激活MEK1-ERK1/2可增強小鼠肌肉代謝效率、耗氧量及肌肉抗疲勞能力[33]。由此可見，上述兩條通路可通過改善機體氧化應激而達到緩解體力疲勞的效果，這也與GO（BP）富集分析得到的補中益氣丸調控氧化應激反應與活性氧代謝相一致。王蕾等[16]亦發現補中益氣丸對線粒體氧化磷酸化過程有一定的保護作用，可明顯升高小鼠急性運動后腦組織呼吸鏈復合體Ⅱ和Ⅳ活性，防止急性運動后腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的下降，保障呼吸電子傳遞鏈電子傳遞功能的正常。

在KEGG富集的前20條通路中，有4條為癌癥通路：前列腺癌、胰腺癌、癌癥中的蛋白多糖及MicroRNAs，可見疲勞是癌癥發生發展及治療干預過程中伴隨的病理現象，CRF嚴重影響患者的生命質量[34-35]。有5條與病毒感染相關通路，而病毒感染亦與癌癥有關，世界衛生組織將本次度值排名第一位的卡波濟氏肉瘤皰疹病毒（KSHV）列入“一類致癌病毒”清單中。研究指出MAPK和PI3K-AKT信號通路與腫瘤有著千絲萬縷的關系，它們的雙重抑制在理論上是一種很有前途的抗癌方法，但其臨床應用仍有待研究[36]。活性成分之一木犀草素通過調節活性氧誘導的P38MAPK/NF-κB通路和鈣誘導的線粒體凋亡信號通路保護HO誘導的氧化應激：上調人內皮細胞eNOS表達，下調iNOS表達、線粒體膜bcl-2/bax比值及線粒體細胞色素C的釋放，從而增強細胞抗凋亡能力，起到抗腫瘤作用[37]，進而減輕CRF癥狀。甘草查爾酮A在多種腫瘤細胞中表現出促凋亡自噬，抗細胞增殖的作用[38-39]從而具有一定抗癌作用。另有研究發現槲皮素與多種癌癥相關途徑相互作用，通過調節PI3K-AKT/mTOR通路、Wnt/β-catenin通路和MAPK/ERK1/2通路，對癌細胞和腫瘤發揮抗癌作用[40]。Maurya等[41]用300 μmol/L槲皮素預處理可抑制H2O2誘導的ROS的增加，顯著下調AKT、PDK1、BAD的磷酸化及腫瘤壞死因子TNFR1水平，并上調抑癌基因PTEN水平，結果提示槲皮素和PI3K抑制劑PI-103抑制PI3K-AKT途徑以調控腫瘤細胞的作用機制相似。

在疲勞的生物學基礎中，炎癥介質可能發揮重要作用，疲勞是免疫介導的炎癥和感染后經常觀察到的一種臨床癥狀，生物體對感染、疾病行為的適應性反應可最大限度地減少能量消耗，并通過炎癥消退來改善能量代謝效率[42]。由分析結果可知，本研究中與炎癥相關生物過程與通路的度值普遍偏高，例如脂多糖（LPS）應答及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路，LPS是革蘭陰性菌主要的致病物質，也是導致嚴重炎癥感染的直接原因，其與機體免疫功能的密切關系，生命科學研究常常提取LPS進行誘導生長促進因子如白細胞介素的合成與分泌及動物炎癥反應[43-44]。而“糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路”涉及TNF、CASP3、IL6、IL1B、STAT1等炎癥介質，以腫瘤壞死因子TNF為例，其主要由活化的單核巨噬細胞產生，活化的TNF與細胞膜中的受體（TNFR1，TNFR2）結合，導致許多基因的激活，啟動核因子κB通路和MAPK通路[45]，大量TNFα可參與誘導IL-1、IL-6、IL-8的表達，從而釋放細胞因子和炎癥介質，引起組織壞死。本次篩選到的活性成分山柰酚能降低HO和百草枯誘導的氧化應激和炎癥反應，降低炎癥標志物如核因子κB、TNF-α、IL-6的含量[46]，從而改善能量代謝，緩解體力疲勞。

提高及機體能量供給，改善能量代謝水平亦是緩解疲勞的重要機制之一，值得關注的相關通路如AMPK信號通路，AMPK激酶可感知細胞能量和營養水平，在機體中維持能量代謝的完整性和脂肪代謝的效率，是一種燃料傳感器和調節器，在不同的組織中促進ATP的產生和抑制ATP的消耗，AMPK激酶通常被低ATP水平激活，可促進GLUT4的轉錄和轉位，導致胰島素刺激的葡萄糖攝取增加[47-48]。藥效學試驗中測定的小鼠負重力竭游泳時間直接反映小鼠的運動耐力，運動耐力依賴于包括糖原的儲存、脂肪的消耗和代謝產物的積累等因素;肝糖原作為重要的能源儲備物質用于補充血糖的消耗，使得機體內的血糖保持長時間的穩定，推遲疲勞發生;血清尿素氮主要反映機體內蛋白質的代謝情況，機體在長時間運動后，體內能源儲備糖原物質消耗，就會開始消耗體內蛋白質，從而產生大量尿素，機體對運動負荷的適應性越低，形成的尿素越多。以上3個指標皆反映機體能量代謝，試驗結果表明補中益氣丸可顯著提高機體耐力，但不明顯著改善機體能量代謝水平，可能是給藥劑量過小的原因。

綜上所述，補中益氣丸具有多成分-多靶點-多途徑的作用特點，通過改善機體氧化應激反應，調控細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能及減輕免疫介導的炎癥和感染進而緩解疲勞，但是在調節機體能量代謝方面未有明顯的富集效果，這與藥效學試驗結果相符，推測補中益氣丸在緩解病理性疲勞方面效果更加顯著。

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（2020-01-20收稿 責任編輯：魏慶雙）