外周血及腫瘤組織中膜聯蛋白 A 3、缺氧誘導因子-1α表達對結直腸癌鉑類耐藥的預測價值

朱利芹，宗明珠，杜楠#

1復旦大學附屬華山醫院靜安分院呼吸科，上海 200040

2淮安市第一人民醫院腫瘤內科，江蘇 淮安 223300

結直腸癌為消化系統中一種常見的惡性腫瘤，發病率僅次于胃癌，居消化系統惡性腫瘤的第二位。目前結直腸癌主要采用手術治療，但結直腸癌早期多無典型表現，癥狀易與其他腸道、肛周疾病混淆，因此多數患者確診時病情已經進展至中晚期而失去了最佳手術時機。另有部分患者因腫瘤體積較大、粘連程度較嚴重或腫瘤處于低位接近肛周，而使手術治療保肛難度加大。即使成功開展手術治療，結直腸癌術后仍具有較高的復發率。因此于圍手術期給予輔助化療已經成為結直腸癌手術治療的重要組成部分。輔助化療能夠增加手術治療機會，提高保肛率，輔助殺滅術后殘余微小腫瘤病灶，預防復發，延長患者生存時間。鉑類藥物為目前結直腸癌化療的常用藥物，當患者對鉑類藥物耐藥時可直接影響化療療效，對患者的手術治療、預后均構成嚴重不良影響。因此預測結直腸癌對于鉑類藥物是否耐藥，可為化療藥物的選擇提供重要參考。膜聯蛋白A3、缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可通過多種途徑提高結直腸癌細胞對于鉑類藥物的耐藥性。本研究客觀評估膜聯蛋白A3與HIF-1α在結直腸癌對鉑類藥物耐藥性預測中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2020年6月淮安市第一人民醫院收治的結直腸癌鉑類藥物化療患者的病歷資料。納入標準：①經手術病理或活檢確診為結直腸癌；②美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）結直腸癌TNM分期系統（第7版）分期為Ⅱ～Ⅲ期；③相關資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②化療前接受過分子靶向治療和（或）免疫治療；③有免疫功能異常史；④有血液系統疾病史。根據納入、排除標準，共納入102例結直腸癌鉑類藥物化療患者，按首個化療周期對鉑類藥物的敏感情況劃分為有效組（63例）與耐藥組（39例）。有效組患者中，男39例，女24例；年齡46～81歲，平均（64.07±8.96）歲；TNM分期：Ⅱ期37例，Ⅲ期26例。耐藥組患者中，男24例，女15例；年齡48～79歲，平均（63.84±8.71）歲；TNM分期：Ⅱ期22例，Ⅲ期17例。兩組患者年齡、性別、TNM分期比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 評價標準 全部患者均接受鉑類藥物化療，于1個化療周期結束后評估耐藥情況。以化療后與化療前相比腫瘤病灶未見縮小，達實體瘤療效評價標準的無效標準；化療結束后達完全緩解，隨后于6個月內出現復發；符合任意一種情況為耐藥，無上述表現為敏感。以此結果為金標準，并據此分組。

1.2.2 外周血檢測 于入院后治療前采集全部患者清晨空腹肘前靜脈血5 ml，滴加抗凝劑后于無菌室內22～26℃靜置20 min，置入離心機，離心半徑設置為12.5 cm，轉速設置為3000 r/min，處理10 min取得血清。按化學發光免疫分析法檢測膜聯蛋白A3水平，按酶聯免疫吸附法檢測HIF-1α水平，操作步驟按試劑盒說明書執行。

1.2.3 腫瘤組織免疫組化檢測 于術前活檢時采集全部患者的腫瘤組織。采用免疫組織化學染色檢測腫瘤組織中膜聯蛋白A3、HIF-1α水平，行二甲苯脫蠟，梯度酒精洗脫，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 3次后，滴加0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液，煮沸后修復抗原，加入3%的HO孵育3 min，清除內源性過氧化酶。加3%的山羊血清封閉液體，于37℃條件下孵育10 min，棄去封閉液；分別滴加1∶500鼠抗人膜聯蛋白A3單克隆抗體、鼠抗人HIF-1α抗體，于4℃條件下孵育過夜。以PBS沖洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，37℃下孵育30 min，以PBS沖洗3次；隨后加入新配置的二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，以自來水沖洗、復染、封片。結果判定：由兩位病理科醫師采用雙盲法閱片，于顯微鏡下隨機選取10個視野，依據腫瘤細胞染色強度與陽性細胞占比評定。染色強度：染色與陰性對照一致計0分，淡黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，褐色染色計3分。陽性細胞占比：0%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，﹥75%計4分。兩項評分之和作為評價結果，合計計分﹤4分為陰性，≥4分為陽性。

1.3 觀察指標

對比有效組與耐藥組患者外周血與腫瘤組織中膜聯蛋白A3、HIF-1α表達水平，分析外周血及腫瘤組織中膜聯蛋白A3、HIF-1α表達水平及二者聯合應用對結直腸癌鉑類耐藥的預測價值。外周血與腫瘤組織中膜聯蛋白A3、HIF-1α聯合應用采用Logistic擬合。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 外周血中膜聯蛋白 A 3、HIF-1 α表達水平的比較

耐藥組患者外周血中膜聯蛋白A3、HIF-1α表達水平均明顯高于有效組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組患者外周血中膜聯蛋白 A 3、HIF-1 α表達水平的比較（±s）

2.2 腫瘤組織中膜聯蛋白 A 3、HIF-1 α對鉑類耐藥預測價值的ROC分析

腫瘤組織中膜聯蛋白A3、HIF-1α及二者聯合對結直腸癌鉑類耐藥均具有中等預測價值。（表2、圖1）

表2 腫瘤組織中膜聯蛋白 A 3、HIF-1 α對鉑類耐藥預測價值的ROC分析

圖1 腫瘤組織中膜聯蛋白A 3、HIF-1 α單獨及聯合應用對鉑類耐藥預測價值的ROC曲線

2.3 外周血中膜聯蛋白 A 3、HIF-1 α對鉑類耐藥預測價值的ROC分析

外周血中膜聯蛋白A3與HIF-1α聯合應用對結直腸癌鉑類耐藥具有較高預測價值，膜聯蛋白A3最佳截斷值為1.970 mg/L，靈敏度為76.92%，特異度為100%；HIF-1α具有中等預測價值，最佳截斷值為183.750 pg/ml，靈敏度為76.92%，特異度為68.25%。（圖2、表3）

表3 外周血中膜聯蛋白 A 3、HIF-1 α對鉑類耐藥預測價值的ROC分析

圖2 外周血中膜聯蛋白A 3、HIF-1 α單獨及聯合應用對鉑類耐藥預測價值的ROC曲線

3 討論

結直腸癌為臨床上一種常見的惡性腫瘤，化療在結直腸癌的治療與手術綜合治療中均具有重要作用。鉑類藥物為結直腸癌化療的常用藥物，但患者對于鉑類藥物的敏感性具有較大的個體差異。結直腸癌患者對鉑類藥物的耐藥性可直接影響化療效果，對患者的術后復發與預后生活質量造成嚴重不良影響。因此盡早預測患者對鉑類藥物的耐藥性，應用更為敏感的化療藥物能夠提高結直腸癌的臨床療效，降低復發率，改善患者生活質量。

HIF-1α是一種參與結直腸癌諸多信號通路，發揮調控腫瘤血管生成、控制腫瘤細胞增殖與能量代謝、抑制腫瘤細胞凋亡的細胞因子。在化療過程中腫瘤病灶內部形成許多乏氧細胞，HIF-1α可為這些乏氧細胞提供能量，從而提升了腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，影響化療療效。HIF-1α高表達時不僅能夠提高結直腸癌對化療的敏感性，同時還具有促進結直腸癌進展與轉移的作用。膜聯蛋白A3是一種Ca依賴磷脂結合蛋白，與腫瘤細胞的諸多生物功能具有密切相關性。在膀胱癌、肺癌、卵巢上皮癌等惡性腫瘤組織中膜聯蛋白A3均可見異常高表達，提示膜聯蛋白A3與包括結直腸癌在內的諸多惡性腫瘤的發生、發展均具有相關性。謝祥紅和劉芳研究認為膜聯蛋白A3能夠降低腫瘤細胞內部鉑類藥物與DNA的結合水平，從而導致腫瘤細胞對鉑類藥物耐藥。在順鉑作用后的腫瘤細胞中，膜聯蛋白A3高表達的腫瘤細胞成瘤率明顯高于膜聯蛋白A3低表達的腫瘤細胞，但膜聯蛋白A3對紫杉醇、表柔比星等藥物作用后的細胞成瘤率并未見明顯差異。因此提示膜聯蛋白A3極大可能為鉑類特異性耐藥分子標志蛋白。

本研究結果表明，耐藥組患者外周血中膜聯蛋白A3、HIF-1α表達水平均高于有效組，提示耐藥組患者外周血中膜聯蛋白A3、HIF-1α表達水平具有作為結直腸癌鉑類耐藥標志物的理論可行性。經ROC曲線分析，外周血中膜聯蛋白A3對結直腸癌鉑類耐藥具有較高預測價值，當結直腸癌患者外周血中膜聯蛋白A3﹥1.970 mg/L時提示患者對鉑類藥物耐藥，此時的靈敏度為76.92%，特異度為100%；當結直腸癌患者外周血中HIF-1α﹥183.750 pg/ml時提示患者對鉑類藥物耐藥，此時的靈敏度為76.92%，特異度為68.25%；提示外周血中膜聯蛋白A3水平對于鉑類耐藥的預測價值更高。在外周血與腫瘤組織中，膜聯蛋白A3與HIF-1α聯合應用時均可提高預測價值。

綜上所述，外周血與腫瘤組織中膜聯蛋白A3與HIF-1α水平對結直腸癌鉑類耐藥的預測價值具有一定差異，但均具有中等至較高的預測價值，且二者聯合應用時可提高預測價值；其中外周血中膜聯蛋白A3與HIF-1α水平具有量化性，且取材便捷、重復性好。本研究中尚未涉及膜聯蛋白A3與HIF-1α的聯合應用，且研究納入病例數較少，有待于進一步研究明確。