基于mt DNA COI基因的新疆部分地區葉蟬的分子鑒定

張海燕，陳光輝，古麗扎爾·阿不都克力木，張秀英，王玉濤

（1喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什 844000；2新疆帕米爾高原生物資源與生態重點實驗室，新疆喀什 8440000）

0 引言

葉蟬屬半翅目，角蟬總科(Membracoidea)，葉蟬科(Cicadellidea)昆蟲[1]。全世界已知 43亞科、2345 屬[2]，超過20000種[3]，中國24亞科[2]，約2000種[3]。葉蟬危害植物葉片、根莖部、韌皮組織造成直接損害，部分種類傳播植物病毒[4]，蔡平等[5]統計，植物病毒病媒介昆蟲世界范圍內已知的約397種，其中葉蟬133種，將近1/3，傳播86種病原物[6]。害蟲種系的準確鑒定影響防治方法的有效性[7]，但部分葉蟬體型和體色易隨發育階段或生境改變[8]，如廣頭葉蟬Macropsinae若蟲的體色、警覺性隨蟲齡變化[9]，也說明葉蟬在低齡期和若蟲期較易防治，但若蟲形態差異較小，鑒定較為困難。DNA條形碼技術補充了形態鑒定法的短板，能夠對不同發育歷期、不同形態、殘體昆蟲有效鑒定，岳巧云等[10]基于COI基因成功鑒定玉米象Sitophilus zeamais幼蟲。崔中翌等[11]基于CO1基因對343頭果蠅Drosophila melanogaster幼蟲或卵成功鑒定。Caterino等[12]利用COI和18S rDNA基因鑒定了伴閻甲亞科Histeridae的幼蟲。1993年Fang[13]首次用16SrRNA基因序列法研究了角頂葉蟬Dloctephaliane的系統發育。Johnson等[14]用16SrRNA、ND1和tRNA基因分析了紅額葉蟬屬Errhomus幾種葉蟬的種間親緣關系。Palomera、Bluemel[15-16]利用COI基因分別研究了玉米黃翅葉蟬Dalbulusmaidis和黃條脊冠葉蟬Aphrodes leafhoppers的遺傳多樣性。BOLD數據庫中記錄了1973種葉蟬，擁有條形碼的有1414種，4461條葉蟬的條形碼被記錄[17]。戴仁懷等[18]在2008年，基于28S rDNA D2、16S rDNA首次在國內分析研究角頂葉蟬亞科進化關系。倪俊強等[19]基于COⅡ基因分析了閩桂地區尖凹大葉蟬Bothrogonia acuminata5個地理種群的進化地位。俞鵬飛等[20]采用引物步移法研究白邊大葉蟬Kolla paulula(Walker)線粒體基因組序列特征，發現白邊大葉蟬屬角蟬總科葉蟬科。喬利等[21]通過Cytb、COI基因，明確了信陽地區4種葉蟬種類、遺傳關系。中國對于葉蟬的DNA條形碼研究大多集中于對成蟲的研究，對葉蟬若蟲的研究較少。昆蟲幼蟲的形態分類是個難題[22]；COI基因進化速率快、序列保守，分子標記效果較好[23-24]。基于此，本研究首先通過形態分類，對未知葉蟬分類識別；提取葉蟬基因組，基于mt DNACOI基因，對提取的基因組用通用引物PCR擴增、測序；對目的基因序列用生物信息學軟件進行相似性分析、計算種間距離、分析遺傳進化地位，獲得不同種類葉蟬快速鑒定的DNA條形碼。南疆與多國接壤，較容易遭生物入侵，作為農業大區，植被種類多，易于葉蟬生存，但區域內葉蟬分類識別基礎薄弱，研究葉蟬DNA條形碼的報道更為少見。本研究選用COI基因對4種葉蟬若蟲和2種成蟲進行分類鑒定，可豐富邊境地區葉蟬基因數據庫、為維護生物安全和害蟲有效防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

本研究葉蟬樣本分布于新疆部分農田，用捕蟲網掃捕、黃板誘捕獲得（表1）。首先形態分類鑒定，初步分為6種葉蟬標本，標記為A、B、C、D、E、F，在離心管中加入99%的無水乙醇，將標本放入離心管，冷藏于4℃冰箱中，實驗于2020年5—10月在新疆帕米爾高原生物資源與生態重點實驗室開展。

表1 葉蟬標本信息

1.2 儀器設備

體視顯微鏡(Motic Cam2506 SMZ168)、離心機(BECKMAN COULTERTM AllegraTM X-22R Centrifuge)、FM100 雪花制冰機(YKKY)、振蕩器(IKA MS3 digital)、恒溫水浴鍋、PCR儀（Veriti TM 96-Well PCR 4375786新加坡制造）、伯樂Bio-RadPowerpacHC電泳設備、凝膠成像儀(Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR)等。

1.3 提取葉蟬DNA基因組

由于葉蟬若蟲體型較小，為保證基因組提取效果，參照鄒志文等Chelex100改進法提取葉蟬DNA[25]。

（1）取1只葉蟬，用雙蒸水在離心管中將樣本清洗數次，后將樣本置于濾紙上數分鐘直至干燥。

（2）將干燥的葉蟬樣本放入離心管中(1.5 mL)，對玻璃棒高壓滅菌后緊貼管壁充分研磨樣本。

（3）吸取0.5 mL雙蒸水（已滅菌），加入裝有葉蟬樣本的離心管中，充分渦旋溶液至均勻，放入-70℃冰箱中冷卻4 min。

（4）將離心機參數設置為12000 r/min，將溶液離心5 min，緩慢抽取上清棄去，只留下沉淀，重復此步驟3次。

（5）將5%的Chelex-100溶液搖勻，抽取120 μL，加入到沉淀中，調整恒溫水浴鍋的溫度為56℃，將溶液搖勻后加熱2 h。

（6）渦旋5～10 s，將離心管封口（防止溶液噴濺）放入100℃的恒溫水浴鍋，加熱10 min。

（7）渦旋溶液 5～10 s，將離心機參數設置為10000 r/min，將溶液離心5 min，提取離心所得上清液，在-20℃條件下保存，作為DNA模板。

1.4 基因組PCR擴增

引物由北京奧科生物公司合成，上游引物LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物 HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGAC CAAAAAATCA-3’[26-28]。使用通用引物對COI序列PCR擴增，擴增體系總體積設置為21 μL，其中2×Taq酶7.2 μL，ddH2O 12 μL，上下游引物各為0.4 μL，DNA模板1 μL。反應條件及步驟為：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環40次，循環結束后72℃延伸7 min，4℃條件下保存。PCR產物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.5 處理數據、構建系統進化樹

將擴增的目的基因送專業測序公司測序，經測序儀生成abi文件，首先用Chromas 2.6.6軟件打開測序獲得的基因序列的峰圖，查找誤讀的堿基手動校正。用DNAMAN4.0軟件進行序列正反鏈拼接匹配校正。用NCBI數據庫的BLAST程序比較序列同源性，確定所測序列屬昆蟲COI基因序列。下載Score較高、Query cover大于90%、Per ident高于80%的序列，用ClustalX 1.83軟件比對下載序列與測序所得序列。用MEGA7.0.14統計序列堿基組成、變異位點、核苷酸組成。選用Kimura 2-Parameter模型計算種間遺傳差異，用DAMBE7.2.136基于P距離分析序列堿基替換飽和性、檢測系統發育信號。用NJ鄰接法(Neighbour-Jioning)構建系統進化樹，循環1000次，估計進化樹中節點的置信度(bootstrap confidence level，BCL)。

2 結果與分析

2.1 葉蟬標本初步形態鑒定

參照表2中葉蟬成蟲及若蟲的形態特征及6個葉蟬樣本的外部形態，初步劃分樣本所屬類群，經分析所研究樣本分屬6個亞科，6種葉蟬背面、側面、腹面形態特征見圖1。

圖1 6種葉蟬形態特征圖

表2 6種葉蟬形態特征

續表2

2.2 序列分析

本研究獲得葉蟬核酸序列共6條，其中4種葉蟬若蟲（樣本A、B、C、D）的4條序列屬首次獲得，2種葉蟬成蟲（樣本E、F）的2條COI序列在新疆首次報道。經NCBI數據庫中的BLAST程序，發現與該序列同源性最高的是昆蟲的COI基因序列，確定所測序列為COI基因序列。下載GeneBank中與該COI序列同源性較高的葉蟬的序列，將測序獲得序列與下載序列用ClustalX1.83軟件比對分析，非保守區域去除，測序拼接后僅以表6中的序列長度進行分析。COI基因核苷酸組成見表3，本研究6個樣本的COI序列的A+T含量分別為65%、72%、67%、69%、67%、68%，COI基因的A+T含量高于G+C，A+T堿基偏移性明顯，與昆蟲mt DNA基因堿基構成特點一致，成功對葉蟬樣本的COI基因序列在分子水平上監測分析。

表3 mt DNA核苷酸堿基組成表

2.3 分子鑒定結果分析

將獲得的葉蟬樣本的COI序列在GenBank中進行比對，可獲得相似度高低排列表，結果顯示均和葉蟬相關序列的相似性最高。COI序列覆蓋度大于90%、相似度大于95%，被認定為達到鑒定標準[39]。COI序列相似度大于98%被認為達到鑒定標準或水平[40]。本研究獲得的6條COI基因序列中，3個葉蟬樣本與NCBI中相關序列相似度高達98%，大于或等于鑒定標準98%，可以鑒定為該類昆蟲，鑒定依據和結果如表4所示。樣本A與KR564712.1條沙葉蟬Psammotettix confinis COI基因的相似度為99.02%，確定為條沙葉蟬。樣本B與MF716879.1大青葉蟬Cicadella viridis COI基因的相似度為99.09%%，確定為大青葉蟬。樣本E與JQ755806.1多態廣頭葉蟬Macropsis notate COI基因的相似度為100%，確定為多態廣頭葉蟬。樣本C與HQ929177.1紅帶鏟頭葉蟬Hecalus arcuatus的相似度只有85.5%，未達到鑒定標準，經形態特征鑒定初步鑒定為鏟頭葉蟬亞科Hecalinae鏟頭葉蟬屬Hecalus Stal葉蟬，由于該樣本為若蟲，尚未發育完全，形態特征不明顯，無法將其鑒定到種，故該葉蟬鑒定為鏟頭葉蟬屬葉蟬。樣本D與KR560629.1斑葉蟬族Erythroneura vitifex的相似度只有87.7%，未達到鑒定標準，經形態特征鑒定初步鑒定為阿小葉蟬屬Arboridia Zachvathin葡萄阿小葉蟬Arboridia kakogawana，（斑葉蟬屬Erythroneura和阿小葉蟬屬Arboridia均屬斑葉蟬族）。樣本F與JF737032.1六點葉蟬Macrosteles sexnotatus的相似度最高，達到91.92%，但未達到鑒定標準，經形態特征鑒定初步鑒定為殃葉蟬亞科Euscelinae二叉葉蟬屬MacrostelesFieber六點葉蟬Macrosteles sexnotatus，形態特征與分子鑒定結果一致，該葉蟬為六點葉蟬。本研究中葉蟬樣本的形態特征鑒定結果與分子鑒定結果基本一致，樣本C、D、F的COI基因序列相似度與NCBI中相關葉蟬的相似度存在一定的差距，與樣本的蟲態、新疆對葉蟬的條形碼研究較少數據庫中數據不夠全面有關。

表4 葉蟬樣本COI基因鑒定依據及結果

2.4 堿基替換飽和性分析

啟動DAMBE7.2.136軟件，P距離位于橫軸，轉換(s)和顛換(v)位于縱軸，繪制函數曲線圖，以此檢測堿基替換是否飽和[41]，詳見圖2。由圖2可知COI序列組的轉換值隨著P距離增加而升，與P距離存在較強的線性關系，可知本研究中序列堿基替換未飽和，可進行系統進化地位分析[41]。

圖2 葉蟬COI基因序列堿基替換飽和性

2.5 葉蟬系統發育分析

從NCBI數據庫篩選下載覆蓋度大于90%、同源性80%以上的葉蟬科昆蟲的COI基因序列，與實驗所得序列，用MEGA7.0.14構建COI葉蟬部分屬種NJ分子進化樹（圖3）。本研究分析的6種葉蟬在系統發育樹上的位置清晰，分類明確，各種在各分類階元間形成各自獨立的單系。本研究樣本的CO1序列和葉蟬類昆蟲相關序列分為2個大支，屬間以亞科為分支聚類為6個小支，和已知葉蟬相關序列以較高置信值聚在一起，明顯將6種葉蟬準確區分開來。阿小葉蟬屬位于進化樹的根部，是葉蟬科最為原始的類群[42]。

圖3 與葉蟬相關的部分種類的COI基因系統進化NJ樹（數字表示置信度，用紅色菱形標注樣本）

2.6 遺傳距離分析

用MEGA 7.0.14軟件，基于K2P距離模型，計算6種葉蟬不同個體的COI基因序列間的遺傳距離，如表5所示。6種葉蟬種間遺傳距離為0.183～0.265，種間遺傳距離平均數為0.232；鑒定到種的樣本A、B、E種內遺傳距離分別為0.0037、0.0019、0.0037，遠低于0.01。種內平均遺傳距離小于0.01，種間平均遺傳距離大于0.2，符合“10倍閾值定律”[40]且與形態分類結論一致[43]，對6種葉蟬成功分類鑒定，因此，這些mt DNA序列可以作為鑒定葉蟬科昆蟲的DNA條形碼[44]。

表5 6種葉蟬COI基因種間遺傳距離

3 討論

3.1 葉蟬mt DNA堿基組成特征

本研究中6個樣本的COI基因序列A+T含量明顯高于G+C，表現出明顯的A/T堿基偏嗜，與昆蟲線粒體基因序列堿基組成特點一致[45]。高婭蓉等研究小葉蟬亞科5個族的COI基因片段序列時得出小葉蟬亞科5個族A+T含量為69.2%，含量較高[46]，與本研究結果一致。確定了mt DNACOI基因序列可作為葉蟬的DNA條形碼，獲得COI基因序列6條，其中4條葉蟬若蟲的COI基因序列為葉蟬科昆蟲首次報道，2條葉蟬成蟲序列為新疆首次報道。

3.2 葉蟬mt DNA分子鑒定結果

本研究中樣本C、D、F的COI基因序列與NCBI數據庫中相關葉蟬的COI基因序列相似度之間有一定差距，未達到鑒定水平。經查證葡萄阿小葉蟬COI基因序列在各類網絡數據庫中均未記錄，故本研究中獲得的樣本D葡萄小葉蟬的COI基因序列與斑葉蟬族葉蟬相似度較低。另外新疆溫差較大、干燥少雨、光照強，地理環境特殊，區域內相關昆蟲研究較少，獲得的數據未在條形碼數據庫中登記，造成新疆葉蟬科昆蟲在GenBank數據庫中序列不全，相似度低；另一方面在實驗過程中因機器或人工的中間環節較多，影響實驗結果，而給鑒定結果造成一定誤差，數據被誤傳到數據庫，造成同一物種相似度存在差異。

3.3 葉蟬mt DNA基因的遺傳距離

研究發現絕大多數物種間的COI基因序列之間存在相對較小的種內遺傳距離和相對較大的種間遺傳距離，98%以上的種間遺傳距離大于2%，而種內遺傳距離大多低于1%，很少超過2%[47-48]。本研究6種葉蟬種間遺傳距離平均數為0.232，樣本A、B、E種內遺傳距離平均數為0.0031，遠低于1%，達到鑒定標準。樣本E與F的遺傳距離最大為0.265，樣本A與C的遺傳距離最小為0.183，來自吐魯番的樣本D與來自喀什、克州的其他樣本的地理距離最遠，但遺傳距離并不是最大的，田小娟指出地理間距和遺傳差異之間無相關性[49]，地理距離不會必然導致種群間的遺傳分化[49]。李樂對12種假眼小綠葉蟬的研究發現，全國不同地理位置、海拔和氣候的假眼小綠葉蟬種群間遺傳變異不明顯[50]，與本研究結果一致。本研究中地理環境并不是引起葉蟬遺傳結構差異的主要原因，但本研究采集的樣本地域覆蓋度還較低，不能代表該區域的葉蟬遺傳結構與地理環境的關系，今后將擴大邊境區域及周邊采樣范圍，以期更全面評估該區域葉蟬遺傳多樣性、分布特點等。

4 結論

本研究基于mt DNACOI基因，首先通過形態分類法確定葉蟬的大致類群，再利用DNA條形碼技術，獲得葉蟬COI基因序列，比對序列相似性，分析堿基含量、檢測系統發育信號、計算遺傳距離、構建系統進化關系，確定了6條mt DNACOI基因序列可作為葉蟬快速鑒定的DNA條形碼，其中4種葉蟬若蟲的基因序列為葉蟬科昆蟲首次研究報道。本研究獲得如下結論：（1）經形態特征鑒定，6個樣本分屬6個亞科、6個屬、6種葉蟬；（2）葉蟬的mt DNA基因序列構成特點與昆蟲的mt DNA序列堿基組成特點一致；（3）通過mt DNA序列對比、遺傳距離分析、系統發育構建，確定了本研究6種葉蟬的種類，與形態分類結果一致，獲得基因序列可作為本區域6種葉蟬快速鑒定的DNA條形碼。