某地區(qū)新生兒痰標(biāo)本金黃色葡萄球菌分離株耐藥情況及分子特征

黃金華，傅錦堅(jiān)，梁婧，藍(lán)茜榆（柳州市婦幼保健院，.藥學(xué)部，2.預(yù)防保健科，.新生兒科，廣西 柳州 54500）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是臨床常見(jiàn)感染病原菌之一，根據(jù)2014 至2017年中國(guó)兒童及新生兒患者（≤14 歲）細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告可見(jiàn)[1]：SA 分離率已占兒童及新生兒組革蘭氏陽(yáng)性菌分離率的首位，并呈逐年上升趨勢(shì)。SA 最常侵犯4 個(gè)月以下的嬰幼兒，該年齡段SA的陽(yáng)性分離較高[2]，新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，抵抗力弱，容易感染，為了解本地區(qū)新生兒SA 耐藥情況及分子特征，對(duì)2014—2017年柳州市婦幼保健新生兒病區(qū)痰標(biāo)本分離出的52 株SA 株耐藥情況及mecA基因、SCCmec分型、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因（ermA，ermC）、四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）、殺白細(xì)胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）毒力因子的分子特征進(jìn)行回顧性研究分析，為防治新生兒呼吸道SA 感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集本院2014年1月至2017年12月新生兒病區(qū)呼吸道痰液送檢樣本中分離出的SA 株，剔除重復(fù)菌株，同一患者只選取一株分離株進(jìn)行分析，共52 株。

1.2 分離鑒定

細(xì)菌的分離鑒定按文獻(xiàn)[3]描述的方法進(jìn)行。根據(jù)收集標(biāo)本當(dāng)年發(fā)布的美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)所制訂的標(biāo)準(zhǔn)采用 CLSI 紙片法檢測(cè)所有菌株對(duì)青霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、氨芐西林、頭孢氨芐、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、利福平、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺這14 種抗菌藥物的敏感性。采用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法初步檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant SA，MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-susceptible SA，MSSA）。

1.3 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測(cè)

采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因（ermA，ermC）、四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）[4]、PVL毒力因子基因[5]。參照文獻(xiàn)[6-7]采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（M-PCR）對(duì)SA 攜帶的mecA基因及mecA基因的具體SCCmec分子分型進(jìn)行檢測(cè)。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度條件參考文獻(xiàn)[7]，PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（0.5 μg·mL－1）染色后成像，記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)等級(jí)變量和率的差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s 精確檢驗(yàn)，所有的檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離的SA 對(duì)抗菌藥物耐藥情況及耐藥基因檢出情況

52 株SA 對(duì)青霉素、氨芐西林耐藥率非常高，分別為98.08%、73.08%，對(duì)利福平、左氧氟沙星耐藥率較低（均為1.92%），對(duì)環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺無(wú)耐藥，具體見(jiàn)表1。采用頭孢西丁敏感試驗(yàn)篩查，同時(shí)采用PCR 方法檢測(cè)mecA基因。頭孢西丁敏感試驗(yàn)篩查陽(yáng)性菌均檢出mecA基因，檢出MRSA 11 株，檢出率為21.15%，SA對(duì)氨芐西林、阿莫西林克拉維酸鉀、紅霉素、頭孢氨芐的耐藥性較MSSA 高（P＜0.05）。耐藥基因僅檢出mecA、SCCmecIVd基因、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC耐藥基因、四環(huán)素tetK耐藥基因和毒力因子PVL 基團(tuán)，其他耐藥基因未檢出。其中mecA基因檢出12 株，SCCmecIVd基因檢出11 株，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC耐藥基因檢出12 株，四環(huán)素tetK耐藥基因檢出10 株，毒力因子PVL 基因檢出5 株，具體檢測(cè)情況見(jiàn)表2，部分菌株分型見(jiàn)圖1 ～3。

圖1 部分菌株mecA 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig 1 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for mecA gene

圖2 部分菌株SCCmec 分子分型基因PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig 2 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for SCCmec gene

圖3 部分菌株ermC、tetK、PVL 毒力因子基因PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig 3 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for ermC，tetK and PVL virulence gene

表1 SA 抗菌藥物耐藥情況Tab 1 Antimicrobial resistance of SA

表2 SA 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測(cè)情況Tab 2 Drug resistance gene and PVL virulence gene

2.2 攜帶ermC、tetK 耐藥基因抗菌藥物耐藥情況及分子學(xué)特征情況

攜帶ermC耐藥基因的金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素耐藥率為75.00%，克林霉素耐藥率為66.67%，其中攜帶mecA基因4 株，SCCmecIVd基因3 株，tetK耐藥基因2 株，毒力因子PVL 3 株；攜帶tetK耐藥基因的金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素耐藥率為90.0%，其中檢出攜帶mecA基因4 株，SCCmecIVd基因3 株，tetK耐藥基因2 株，毒力因子PVL 2 株（見(jiàn)表3 ～6）。

表3 攜帶ermC 耐藥基因?qū)咕幬锬退幥闆rTab 3 Drug resistance of bacteria antibiotics carrying ermC resistance gene

表4 攜帶ermC 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測(cè)情況Tab 4 ermC resistance gene and PVL virulence gene

表5 攜帶tetK 耐藥基因抗菌藥物耐藥情況Tab 5 Drug resistance of bacteria antibiotics carrying tetK resistance gene

表6 攜帶tetK 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測(cè)情況Tab 6 tetK resistance gene and PVL virulence gene

3 討論

3.1 SA 耐藥基因檢測(cè)對(duì)抗菌藥物選擇的影響

SA 的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，可能攜帶mecA基因、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因（ermC）、四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）、PVL 毒力因子等耐藥基因及因子，本研究檢測(cè)出攜帶大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC耐藥基因的菌株相對(duì)于未攜帶大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC耐藥基因的菌株對(duì)紅霉素、克林霉素的敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；攜帶四環(huán)素tetK耐藥基因的菌株相對(duì)于未攜帶四環(huán)素tetK耐藥基因的菌株對(duì)四環(huán)素的敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)SA 檢出攜帶大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC耐藥基因時(shí)，則不宜選擇大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物、林可酰胺類(lèi)抗菌藥物抗感染治療；如檢出攜帶四環(huán)素tetK耐藥基因時(shí)，則不宜選擇四環(huán)素類(lèi)藥物抗感染治療。

mecA基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a）能夠替代結(jié)合失活的PBPs 發(fā)揮轉(zhuǎn)肽酶的功能，促進(jìn)細(xì)胞壁的合成而產(chǎn)生耐藥性[8]。由于MRSA 產(chǎn)生的耐藥是因MRSA 獲得mecA基因，編碼產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a），造成對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥，CLSI 明確指出一旦在SA 中檢測(cè)到mecA基因，即可認(rèn)定為MRSA[9]。本研究中有1 株SA 菌株頭孢西丁篩查試驗(yàn)陰性，但檢出mecA基因陽(yáng)性，則仍可認(rèn)定這株菌株為MRSA。

SCCmec 盒式染色體是一種新型的可移動(dòng)元件，大小為 21 ～67 kbp，該元件主要包括mec基因復(fù)合體和染色體重組酶基因ccr復(fù)合體。根據(jù)mec和ccr基因復(fù)合體結(jié)構(gòu)不同，可將SCCmec主要分為5 種基因型[10-11]。醫(yī)院感染MRSA 菌株多攜帶SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，社區(qū)感染 MRSA 菌株多攜帶SCCmecⅣ、Ⅴ。本研究檢出的12 株攜帶mecA基因的SA，同時(shí)攜帶SCCmecIVd基因，考慮來(lái)自于社區(qū)獲得性感染。因社區(qū)健康兒童鼻前庭SA 定植率可達(dá)38.9%[12]，在臨床治療上首先要判斷是定植菌還是致病菌，以減少不必要的抗菌藥物使用，促進(jìn)臨床抗SA治療的合理性。

PVL 是由SA 產(chǎn)生的一種外毒素，可引起機(jī)體釋放多種炎性介質(zhì)，引發(fā)血管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織壞死等一系列炎性反應(yīng)，最終使細(xì)胞壞死或凋亡而危及生命。本研究的SA 株主要來(lái)自呼吸道標(biāo)本，共檢出5 株菌株攜帶PVL毒力因子，其中攜帶ermC耐藥基因的SA 中檢出PVL 毒力因子3 株，未攜帶ermC耐藥基因的SA 中檢出PVL 毒力因子2 株，如采用χ2檢驗(yàn)時(shí)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但因當(dāng)1 ≤理論數(shù)（T）＜5，n≥40 時(shí)，采用Fisher’s 精確檢驗(yàn)計(jì)算P＞0.05，則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同地區(qū)SA 所攜帶的耐藥基因及毒力等情況可能會(huì)有所不同，如一項(xiàng)對(duì)1992—2010年醫(yī)院MRSA克隆分布的研究顯示：分離出攜帶ermC介導(dǎo)的紅霉素和克林霉素耐藥的MSRA 菌株檢出PVL呈陰性[13]，而一項(xiàng)攜帶PLV 毒力因子的MRSA研究中發(fā)現(xiàn)：MRSA 分離菌中檢出攜帶PVL 毒力檢出率為29.2%，其中攜帶ermC耐藥基因占18.6%，是最常見(jiàn)的耐藥基因[14]。

3.2 結(jié)語(yǔ)

因新生兒的特殊生理特點(diǎn)，復(fù)方新諾明、四環(huán)素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星不能用于新生兒，慶大霉素等氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物因耳毒性、腎毒性等不良反應(yīng)，兒童須在監(jiān)測(cè)藥物血藥濃度的前提下謹(jǐn)慎使用，一般也不首選，因此對(duì)于新生兒SA 的藥物治療選擇上比較局限。本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)新生兒痰液中檢出的SA 對(duì)青霉素、氨芐西林耐藥高，因此在臨床上新生兒抗SA 治療不應(yīng)選用青霉素、氨芐西林作為SA 的常規(guī)抗感染治療用藥，對(duì)于MSSA 可選擇紅霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢氨芐作為首選治療方案，對(duì)于MRSA 則選用萬(wàn)古霉素、利奈唑胺治療。對(duì)于檢出大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因的SA 菌株，除了對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥外，對(duì)克林霉素耐藥比例也比較高，因此，應(yīng)同時(shí)做克林霉素誘導(dǎo)試驗(yàn)（即D 試驗(yàn)），以便為臨床用藥提供參考。