筋骨寧膏中黃曲霉毒素的測定

倪倩，南文萍，張俐*（. 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 009；. 南京中醫藥大學，南京 003）

筋骨寧膏由骨碎補、鳳仙透骨草、五加皮、生天南星、續斷、蒲公英、當歸、羌活、紅花、土鱉蟲、桃仁、乳香、沒藥、樟腦、冰片、桉葉油、水楊酸甲酯、鹽酸苯海拉明組成。其功效為活血化瘀、消腫止痛、舒筋活絡，主要用于閉合性骨折和跌打損傷。

其藥味之一土鱉蟲別名?蟲、地鱉和土鱉，為鱉蠊科（Corydiidae）昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensisWalker. 或冀地鱉Steleophagaplancyi（Boleny）的雌蟲干燥體。其性寒，味咸，有破淤血、續筋骨的功效，是跌打損傷、消腫止痛和活血化瘀中成藥的常用組成成分。土鱉蟲在采收、加工、運輸及儲存環節中，極易發生霉變并產生黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）。黃曲霉毒素是一種強致癌的霉菌毒素，最常見的是黃曲霉G1（Aflatoxin G1，AFG1）、G2（Aflatoxin G2，AFG2）、B1（Aflatoxin B1，AFB1）、B2（AflatoxinB2，AFB2）。 其 中AFB1的毒性最大，分布最廣，屬于Ⅰ類致癌物。近年來，陸續有文獻報道土鱉蟲中黃曲霉毒素超標的現象[1-2]。有研究表明，AFB1 對人皮膚成纖維細胞具有明顯的細胞毒性作用[3]，說明對外用制劑控制黃曲霉毒素也很有必要。《中國藥典》2020年版一部對土鱉蟲中黃曲霉毒素規定了限度，AFB1 限度為5 μg·kg－1，AFB1、AFB2、AFG1 與AFG2 的總量限度為10 μg·kg－1[4]，但未對土鱉蟲相關制劑黃曲霉毒素進行控制，相關檢測方法并不完善。

本文利用黃曲霉毒素的溶解性（易溶于油、三氯甲烷、甲醇和乙腈，不溶于水、乙醚和正己烷），對可能存在污染的貼膏劑制品建立了新的提取方式，為黃曲霉毒素的檢測與監管提供新思路。

1 儀器與試藥

ExionLC 型超高效液相色譜、AB QTRAP 4500 LC/MS/MS（美國SCIEX 公司）；CPA0045 型萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；TG16-WS 離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統。色譜柱PhenomenxTitank C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水；免疫親和色譜柱（北京華安麥科生物技術有限公司）。黃曲霉毒素混合對照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 標示質量濃度分別為1.04、0.38、1.08、0.38 μg·mL－1，批號：610001-202006，中國食品藥品檢定研究院）。筋骨寧膏（土鱉蟲處方量占處方生藥總量6.7%，江蘇百益制藥有限公司，批號分別為200601-1、210201）。

2 方法與結果

2.1 液相-質譜條件

色譜柱：PhenomenxTitank C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相以10 mmol·L－1醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B；柱溫25℃；流速0.3 mL·min－1；按表1 程序進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子檢測方式；多反應檢測（MRM 模式）；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：5500 V；霧化器：55 MPa；輔助器：60 MPa；各化合物監測離子對和碰撞電壓（CE）見表2。

表2 監測離子對和碰撞電壓Tab 2 Monitoring ion pair and collision voltage

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液500 μL，置50 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為線性1 號溶液。精密量取線性1 號溶液5、4、3、2 和1 mL，分別置25、25、25、25 和50 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液2、3、4、5和6號溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取本品1 g，置50 mL離心管中，加入10 mL 正己烷浸漬1 h，渦旋3 min，即可將背襯層表面的膏狀層完全溶解，呈乳液狀。再精密加入10 mL70%甲醇，渦旋3 min后，9000 r·min－1離心5 min，此時膏狀層和背襯層在瓶底聚集，溶液分為澄清的上下兩層，黃曲霉毒素溶解于下層的70%甲醇中，精密量取下層液體6 mL，置20 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，9000 r·min－1離心5 min，取全部上清液，通過免疫親和柱，流速3 mL·min－1，用水20 mL 洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過（0.22 μm），取續濾液，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密量取空白溶劑（甲醇）與線性2 號溶液各5 μL，分別注入超高效液相色譜-質譜儀，考察各組分峰形（見圖1）。結果各成分峰形較好，響應值高，空白溶劑中未提取出離子峰，說明對檢測無干擾，所選擇的監測離子對較為合適。

圖1 空白溶劑和對照品溶液的提取離子峰圖Fig 1 Extracted ion chromatogram of blank solvent and reference solution

2.4 線性關系考察

取“2.2”項下系列線性溶液，精密量取5 μL，注入超高效液相色譜-質譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果見表3。

表3 線性關系與范圍Tab 3 Linear relation and range

2.5 精密度試驗

精密量取線性2 號溶液5 μL，連續進樣6 次，以峰面積計算RSD，考察精密度。結果AFG2 峰面積RSD為0.75%，AFG1 為1.6%，AFB2 為1.6%，AFB1 為1.8%，表明本法精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取本品1 g，按“2.2.2”項下方法操作，平行制備6 份，結果6 份樣品中均未檢出黃曲霉毒素。

2.7 檢測限與定量限

取線性6 號溶液逐級稀釋至S/N約為3，即為檢測限，S/N約為10，即為定量限。結果表明，本法靈敏度較高，符合檢測要求（見表4）。

表4 檢測限與定量限結果Tab 4 LOD and LOQ

2.8 加樣回收試驗

精密稱取本品1 g，精密加入線性1 號溶液350 μL，按“2.2”項下方法操作，平行制備6 份，進樣測定，結果加樣回收率見表5。結果表明，各成分回收率在72.80%～86.40%，RSD均小于10%，說明本法可有效提取出制劑樣品中的黃曲霉毒素。

表5 加樣回收試驗結果Tab 5 Recovery

2.9 樣品測定結果

精密量取“2.2.2”項下供試品溶液5 μL，進樣測定，結果表明，2 批樣品中均未檢出黃曲霉毒素。

3 討論

3.1 提取方法的確立

黃曲霉毒素的提取多采用甲醇-水或乙腈-水的提取方式，但是貼膏劑中具有活性物質的膏狀層不溶于甲醇-水或乙腈-水體系，導致包裹在其中的成分難以被提取出。本文中的提取方法將膏狀層完全溶解在正己烷中，再用甲醇-水進行提取，大大提高了黃曲霉毒素的提取回收率。

另外，比較了乙腈-水與甲醇-水的提取效率，結果表明，乙腈-水與甲醇-水的提取回收率幾乎無差別，但乙腈-水提取液顏色偏深，說明干擾物多于甲醇-水體系，因此最終選擇甲醇-水作為提取溶劑。

3.2 分析方法的確立

本文參考2020年版《中國藥典》四部通則2351 真菌毒素測定法，對質譜條件進行了人工優化，使得4 個黃曲霉毒素的檢測靈敏度更高。

3.3 存在的不足

本文雖然為土鱉蟲相關貼膏劑類產品黃曲霉毒素的測定與監管提供了新方法與新思路，但依然存在不足，由于樣本量較少，不能全面評估該類產品的質量。鑒于土鱉蟲相關產品黃曲霉毒素污染情況較為嚴重，并且黃曲霉毒素對表皮細胞存在一定毒性，透皮吸收情況也尚不明確，因此應該加大對此類產品的質量監控，獲取足量數據后再對此類產品的質量監管采取合理措施。