苦參堿及其氯化鈉注射液有關物質檢查方法研究

嚴菲，顧小燕，陳民輝，曹玲*（. 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 009；.中國藥科大學，南京 98）

苦參是豆科植物苦參的干燥根，味苦，性寒，其主要功效為清熱燥濕，殺蟲，利尿，用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡等病癥[1]?？鄥A是苦參中含量最高的主要活性成分之一，其分子結構式見圖1，屬于四環噻嗪啶類?？鄥A具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用[2]，孫靜等[3]研究結果顯示苦參堿對人冠狀病毒肺炎寒濕疫毒襲肺證小鼠病證結合模型具有顯著的治療作用。

圖1 苦參堿結構式Fig 1 Structural formula of matrine

苦參堿及其氯化鈉注射液在各國藥典中均未收載，現行國家標準[4-5]中有關物質檢查采用HPLC 法，但僅控制總雜質含量?？鄥A原料在強堿破壞等條件下能產生槐定堿、氧化苦參堿和槐果堿等雜質，文獻報道[6-7]苦參堿和槐果堿在一定條件下能轉化成較為穩定的氧化形態，即氧化苦參堿和氧化槐果堿。因此，本文擬確定氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和槐定堿為苦參堿原料及氯化鈉注射液中可能存在的已知雜質。在現行標準色譜條件下，上述5 種目標物質無法完全分離，且同時分析苦參堿原料及其氯化鈉注射液中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和槐定堿的色譜方法尚未見報道。

本文在參考文獻方法[8-9]的基礎上，優化了現行標準中有關物質的色譜條件，使5 種目標物質均能良好分離，為科學修訂苦參堿及其氯化鈉注射液的有關物質方法提供參考和依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CPA225D 型電子天平（德國賽多利斯天平公司）；LC-20AB 高效液相色譜儀（島津公司）；Milli-Q 超純水儀（Millipore 公司）；Branson 8800超聲波清洗儀（Branson 公司）；DHG-9041A 電熱恒溫干燥箱（精宏實驗設備公司）；Seven mile pH 計（梅特勒公司）。

1.2 試藥

磷酸二氫鉀、三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，Tiedia 公司）；水為超純水。對照品苦參堿（批號：110805-202010，純度：98.7%）、氧化苦參堿（批號：110780-201909，純度：92.5%）、氧化槐果堿（批號：111652-200301，純度：100.0%）、槐定堿（批號：110784-201706，純度：98.8%）（中國食品藥品檢定研究院），槐果堿（批號：X3420010，純度：98.17%，上海安譜實驗科技股份有限公司）。樣品基本信息見表1。

表1 樣品信息Tab 1 Information of sample

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液[用三乙胺調節pH 值至（6.2±0.1）]（10∶90）；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：10 μL；檢測波長：220 nm；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統適用性溶液 取苦參堿原料及各雜質對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成含苦參堿0.8 mg·mL－1和各雜質10 μg·mL－1的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取苦參堿原料適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成0.8 mg·mL－1的溶液，作為苦參堿原料供試品溶液；取苦參堿氯化鈉注射液作為苦參堿氯化鈉注射液供試品溶液。

2.2.3 對照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，加流動相定量稀釋制成8 μg·mL－1的溶液，作為對照溶液。

2.2.4 對照品儲備液 精密稱取苦參堿對照品和已知各雜質對照品各10 mg 于10 mL 量瓶中，用流動相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度約為1 mg·mL－1的混合對照品儲備液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 精密量取“2.2.1”項下系統適用性溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2。結果表明，各雜質與苦參堿之間、各雜質之間分離度均大于1.5。

圖2 苦參堿系統適用性色譜圖Fig 2 Chromatogram of matrine for system suitability

2.3.2 專屬性試驗 ① 酸破壞溶液：稱取苦參堿原料約16 mg，置20 mL 量瓶中，加6 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，放置24 h，用6 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節pH 值至中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過；② 堿破壞溶液：稱取苦參堿原料約16 mg，置20 mL 量瓶中，加6 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，放置24 h，用6 mol·L－1鹽酸溶液調節pH 值至中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過；③ 氧化破壞溶液：稱取苦參堿原料約16 mg，置20 mL 量瓶中，加30%過氧化氫溶液2 mL，放置24 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過；④ 高溫破壞溶液：稱取經60 ℃加熱6 h 后放冷的苦參堿原料約16 mg，置20 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；⑤ 光照破壞溶液：稱取置（4500±500）Lx光照了24 h 的苦參堿原料約16 mg，置20 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。分別精密吸取上述5 種溶液各10 μL 注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖3。由圖可知，破壞試驗產生的雜質之間、雜質與主成分之間分離效果良好，表明該方法專屬性強。

圖3 苦參堿專屬性試驗色譜圖Fig 3 Chromatogram of the specific properties of matrine

對征集到的空白輔料，用流動相配制成空白輔料溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，考察混合輔料對有關物質檢查的影響。色譜圖見圖4。結果表明輔料對苦參堿有關物質檢查無干擾。

圖4 苦參堿氯化鈉注射液空白輔料溶液色譜圖Fig 4 Chromatogram of matrine sodium chloride injection for blank auxiliary solution

2.3.3 苦參堿與雜質的標準曲線及各雜質相對校正因子的測定 精密吸取對照品儲備液適量，加流動相稀釋制成分別含苦參堿和各雜質質量濃度約為1、5、10、25、50、100、250 μg·mL－1的系列對照品溶液。精密吸取上述5 種溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定保留時間和峰面積。以溶液質量濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸；以苦參堿為參照物，用標準曲線法計算得各雜質的相對校正因子，結果見表2。根據《中國藥典》（2020年版）四部9102 藥物雜質分析指導原則及化學藥物雜質研究的技術指導原則，雜質的校正因子在0.9 ～1.1，可采用主成分的自身對照法進行定量測定，其余雜質采用加校正因子的主成分自身對照法進行定量測定。

2.3.4 定量限和檢測限的測定 取上述線性對照品溶液逐步稀釋，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，以S/N≈10 為定量限，S/N≈3 為檢測限，結果見表2。

表2 苦參堿和各雜質相對保留時間、線性關系和相對校正因子的測定結果Tab 2 Determination results of relative retention time，linearity and relative correction factor of matrine and impurities

2.3.5 精密度試驗 精密吸取質量濃度為10 μg·mL－1的混合對照品溶液10 μL 注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，平行進樣6次，記錄峰面積，結果顯示苦參堿及各雜質峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性考察

① 苦參堿原料：取苦參堿原料（批號：20170211），按“2.2.2”和“2.2.3” 項下方法平行制備供試品溶液和對照溶液各6 份，進樣測定，結果苦參堿原料中各雜質、單個最大未知雜質及總雜質含量RSD＜5%，表明方法重復性良好。

② 苦參堿氯化鈉注射液：取苦參堿氯化鈉注射液（批號：20010542），按“2.2.2”和“2.2.3” 項下方法平行制備供試品溶液和對照溶液各6 份，進樣測定，結果苦參堿氯化鈉注射液中各雜質、單個最大雜質及總雜質含量RSD＜5%。

2.3.7 回收試驗

① 苦參堿原料：分別精密量取對照品儲備液和已知雜質含量的同一批苦參堿原料適量，加流動相制成含各雜質和苦參堿分別約為10 μg·mL－1、0.8 mg·mL－1的溶液，按“2.2.3”項下方法制備對照溶液，平行制備6 份，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。表3 結果表明可以采用該方法對苦參堿原料中已知各雜質進行定量分析且準確度好。

表3 苦參堿原料的回收試驗結果(%)Tab 3 Recovery of matrine (%)

② 苦參堿氯化鈉注射液：分別精密量取對照品儲備液適量，用已知雜質含量的同一批苦參堿氯化鈉注射液劑制成含各雜質和苦參堿分別約為10 μg·mL－1、0.8 mg·mL－1的溶液，按“2.2.3”項下方法制備對照溶液，平行制備6 份，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。表4 結果表明可以采用該方法對苦參堿氯化鈉注射液中已知各雜質進行定量分析且準確度好。

表4 苦參堿氯化鈉注射液的回收試驗結果Tab 4 Recovery of matrine sodium chloride injection

2.3.8 穩定性試驗 按“2.2.2”項下方法配制苦參堿原料及其氯化鈉注射液供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12 h 進樣分析，結果顯示12 h 內苦參堿原料及其氯化鈉注射液供試品溶液中各雜質和雜質總量RSD均小于0.5%，表明兩者溶液穩定性良好。

2.4 苦參堿原料及其氯化鈉注射液有關物質測定

精密稱取苦參堿及氯化鈉注射液，按“2.2.2”和“2.2.3”項下方法配制，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表5。

表5 苦參堿及苦參堿氯化鈉注射液的雜質含量測定結果Tab 5 Content of impurity of matrine and matrine sodium chloride injection

3 討論

3.1 色譜系統的選擇

苦參堿原料藥現行標準中有關物質檢查項采用的流動相為乙腈-水（用磷酸調節pH 值為2.0）-乙醇＝80∶10∶8，色譜柱為NH2柱；其氯化鈉注射液現行標準中有關物質流動相采用乙腈-磷酸溶液（100 mL 水加三乙胺0.2 mL，用磷酸調節pH值至3.2）＝4∶96，色譜柱為C18柱。試驗發現上述兩種色譜系統均不能很好地分離5 種目標物質，且NH2柱色譜系統基線波動很大，重現性更差。因此，本試驗選擇C18柱色譜系統進行優化。

3.2 流動相的選擇

考察了4%、10%、15%乙腈的比例對各色譜峰出峰時間的影響，結果表明乙腈比例越高出峰時間越快，10%乙腈條件下各色譜峰保留時間合適，各峰分離度良好；考察了0.01、0.02、0.05 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液濃度對各色譜峰峰形及分離度的影響，結果表明磷酸二氫鉀溶液濃度越高峰形越好，分離度影響不大，故選擇0.05 mol·L－1濃度的磷酸二氫鉀溶液；進一步考察水相的pH，用三乙胺調節pH 值至5.0、5.6、6.2、6.8，隨著水相pH 值的增加，各峰分離度明顯改善，且pH 為6.2 時，苦參堿保留時間約為11 min，故最終選擇流動相為乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液[用三乙胺調節pH 值至（6.2±0.1）]（10∶90）。

3.3 色譜柱的選擇

采用3 種不同品牌色譜柱[Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU VPODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]考察其對5 種目標物質之間分離度的影響，最終選擇Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，可以達到良好分離測定的要求。