鹽酸倍他司汀中基因毒性雜質甲醛的測定

李沫，張耀文，孫苓苓，徐萬魁（遼寧省藥品檢驗檢測院，國家藥品監督管理局化學藥品質量研究與評價重點實驗室，沈陽 110036）

鹽酸倍他司汀（betahistine hydrochloride）化學名為N-甲基-2-吡啶乙胺二鹽酸鹽，商品名為美克樂（Microer），是由意大利佛曼蒂（Formenti）制藥集團開發的一種組胺H1受體激動劑，是一種常用的血管擴張藥，臨床上主要用于治療各種眩暈綜合征、慢性缺血性腦血管疾病、美尼爾氏綜合征和相關的眩暈癥狀[1-4]。

甲醛是一種有特殊刺激性氣味的無色氣體，易溶于水和乙醇，作為重要的化工原料被廣泛應用于有機合成、合成藥品、材料、涂料、橡膠等行業[5-7]。甲醛是鹽酸倍他司汀在合成過程中的殘留溶劑之一。基因毒性雜質可從基因突變、染色體畸變、DNA 損傷與修復等多個方面同DNA 發生直接或間接的相互作用，從而改變DNA 的結構與構象或引起DNA 的損傷，進而影響DNA 的功能或改變其遺傳特性，最終引起突變、癌變、畸變等遺傳毒性[8-11]。甲醛是確定的基因毒性雜質，人體長期接觸甲醛會對呼吸系統、皮膚、肝肺功能和神經系統等造成危害。

近年來，隨著基因毒性雜質法規的逐漸完善，美國和歐洲藥品監督管理對藥品中含有潛在基因毒性雜質的限度要求越來越高，藥物中基因毒性雜質如果控制不當，可能會導致臨床安全隱患，同時會影響新藥上市，甚至導致已上市藥品的召回事件[9]。開展鹽酸倍他司汀中基因毒性雜質質量控制的研究是非常必要的，故本研究建立了鹽酸倍他司汀原料中基因毒性雜質甲醛的分析方法，以保證鹽酸倍他司汀原料的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC-2010Plus 型氣相色譜儀（配有AOC-5000型自動進樣器和氫火焰離子化檢測器，日本島津公司），ALC-1100.2 型分析天平（瑞士Sartorius 公司），ME204E 型分析天平（美國Mettler 公司）。

1.2 試藥

水中甲醛溶液標準物質（中國計量科學研究院，批號：18001，含量：9.69 mg·mL－1），鹽酸倍他司汀（A 廠原料藥，批號：202010、202012、202016），純化水（杭州娃哈哈集團有限公司，批號：20200301）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用氣相色譜法測定，色譜柱：DB-624（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；進樣口溫度：230℃；檢測器溫度：250℃，程序升溫：起始溫度為40 ℃，以20 ℃·min－1的速率升溫至200 ℃，維持1 min；載氣：氮氣；柱流速：3.0 mL·min－1；進樣方式：溶液直接進樣，進樣量：1 μL，分流比：1∶1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密量取水中甲醛溶液標準物質，用水逐級稀釋至質量濃度為5.5 ng·mL－1，作為對照品儲備液；精密量取對照品儲備液1 mL置20 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（質量濃度為0.275 ng·mL－1）。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取鹽酸倍他司汀0.1 g 置10 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別量取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑（水）進樣，記錄色譜圖，結果見圖1，空白溶劑色譜峰不干擾測定。

圖1 空白溶劑（A）、對照溶液（B）和供試品溶液（C）氣相色譜圖Fig 1 GC chromatogram of the blank solution（A），the control solution（B）and the reference solution（C）

2.4 線性關系考察

取對照品儲備液適量并稀釋成系列質量濃度溶液，進樣，記錄色譜圖，以各成分色譜峰面積（A）為縱坐標，以質量濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸。結果表明，甲醛在0.055 ～1.109 ng·mL－1與測定值線性關系良好，線性方程為A＝1.76×104C＋2.20×103，r＝1.000。

2.5 定量限與檢測限

精密量取“2.4”項下0.055 ng·mL－1的溶液適量，稀釋后進樣，以色譜峰的信噪比S/N為3 計算檢測限，以S/N為10 計算定量限。結果表明，甲醛的檢測限為0.018 ng·mL－1，定量限為0.055 ng·mL－1。

2.6 精密度試驗

2.6.1 重復性試驗 稱取鹽酸倍他司汀0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，加甲醛對照品儲備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，平行操作6 份，分別進樣，結果6 份供試品溶液中甲醛含量均值為0.269 ng·mL－1，RSD為0.70%，表明該方法重復性良好。

2.6.2 中間精密度試驗 照“2.6.1”項下方法配制溶液，在不同時間由另一名試驗人員進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結果12 份供試品溶液中甲醛含量均值為0.269 ng·mL－1，RSD為0.60%，表明該方法中間精密度良好。

2.7 回收試驗

稱取鹽酸倍他司汀0.1 g（甲醛含量為0），精密稱定，置10 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，分別精加甲醛對照品儲備液0.8、1.0 和1.2 mL，每個濃度3 份，用水稀釋至刻度，搖勻，作為回收率樣品溶液。取回收率樣品溶液和“2.2”項下對照品溶液，分別進樣，計算得甲醛低、中、高濃度的平均回收率分別為100.6%、96.9%、97.0%，RSD分別為0.79%、2.1%、1.9%。

2.8 耐用性試驗

按“2.2”項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，分別考察起始柱溫[（40±5）℃]、柱流速[（3±5）mL·min－1]條件對試驗結果的影響，并考察相同填料、不同色譜柱[TG-624（30 m×0.32 mm，1.8 μm），TG-624（30 m×0.53 mm，3 μm）]對試驗結果的影響。結果顯示試驗條件的變動對保留時間、分離度、樣品檢出情況影響較小，方法耐用性良好。

2.9 穩定性試驗

按“2.6.1”項下方法配制溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h 進樣，考察峰面積的RSD，結果表明對照品溶液和供試品溶液RSD分別為0.48%和0.64%，溶液在10 h 內穩定。

2.10 樣品測定

按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果樣品中均未檢出甲醛。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

待測物甲醛和樣品鹽酸倍他司汀在水中均有良好的溶解性，尤其是甲醛，考慮到其標準物質是水溶液，故選擇水作為溶劑。

3.2 檢測方法的選擇

目前檢測藥品中微量的甲醛，主要的測定方法有分光光度法、熒光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效液相/氣相色譜-質譜聯用法（HPLC/GC-MS）等[12]。前3種方法，樣品都需要衍生化后再進行測定，試驗操作繁瑣，檢驗靈敏度低。HPLC/GC-MS 法具有靈敏度高、分辨率高、檢測限低等優點，但是儀器成本較為昂貴，應用不夠廣泛。本研究選擇氣相色譜直接進樣法，操作簡單快捷，避免了樣品預處理的繁瑣步驟和試劑消耗量大的缺點，同時滿足了檢測靈敏度的需求，為甲醛的檢測提供了切實可行的試驗方法。

3.3 色譜條件的選擇

本試驗選用DB-624 毛細管色譜柱（固定液為6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷），此色譜柱對弱極性有機溶劑有較好的適用性。為了使樣品不干擾測定，本試驗采用程序升溫的方法，并對升溫條件進行了優化，使待測物有比較合適的保留時間的同時，樣品中的成分不干擾待測物的分離。

3.4 甲醛限度確定的依據

根據毒理數據查詢CPBD（致癌效力數據庫）可知，甲醛的最小毒理學數據TD50＝1.35 mg/（kg·d），ADI ＝TD50/5000×50 kg ＝1.35 μg·d－1，鹽酸倍他司汀最大日劑量Dose 為50 mg·d－1，最終甲醛的限度為ADI/Dose ＝2.7×10－5g·g－1。