高效液相色譜法測(cè)定克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量

郭丹峰，雷建剛，章澤恒（. 嘉實(shí)（湖南）醫(yī)藥科技有限公司，長(zhǎng)沙 4027；2. 湖南省藥品審評(píng)認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)沙 4003）

克林霉素磷酸酯為化學(xué)半合成的克林霉素衍生物，體外無(wú)抗菌活性，在堿性磷酸酯酶作用下迅速水解為克林霉素，進(jìn)而表達(dá)藥理活性，其抗菌譜、抗菌活性及治療效果與克林霉素相同?？肆置顾亓姿狨ズ涂肆置顾叵啾龋哂懈鼉?yōu)的脂溶性及滲透性，臨床應(yīng)用更加廣泛[1-2]?？肆置顾亓姿狨プ⑸湟褐泄δ苄暂o料包括苯甲醇和依地酸二鈉，苯甲醇含量的限度和檢測(cè)方法已被《中國(guó)藥典》收錄[3]，依地酸二鈉限度和檢測(cè)方法未被收錄，也無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

依地酸二鈉作為金屬離子螯合劑，可防止由原輔料、生產(chǎn)設(shè)備和包材引入的元素雜質(zhì)催化藥液發(fā)生氧化水解或生成絮狀沉淀，提高藥物的穩(wěn)定性[4-5]，但其濃度過(guò)高時(shí)可能引起血鈣濃度下降。為保證保障患者的用藥安全，應(yīng)建立克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量檢測(cè)方法并對(duì)其含量進(jìn)行有效控制。

1 材料

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（Agilent Technologies Co. Ltd，USA）；梅特勒XS105DU型分析天平、梅特勒FE-28 型pH 計(jì)（METTLER TOLEDO，Switzerland）；Milli-Q 超純水儀（Merck KGaA，Germany）。

依地酸二鈉（批號(hào)：R028C1，純度以100%計(jì)，USP）；甲醇（色譜純，Sigma）；水為超純水；甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；25%四丁基氫氧化銨（分析純，天津光復(fù)）；三氯化鐵（分析純，阿拉?。?；克林霉素磷酸酯注射液（批號(hào)：DP6232，輝瑞，規(guī)格為300 mg/2 mL，依地酸二鈉的處方含量為0.5 mg·mL－1；批號(hào)：20063021，與輝瑞處方和規(guī)格相同的自制品）；按照參比制劑處方配制不含依地酸二鈉的克林霉素磷酸酯注射液（批號(hào)：200615，自制）。

2 方法

2.1 色譜條件

照高效液相色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0512）測(cè)定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.006 mol·L－1的四丁基氫氧化銨溶液（取25%四丁基氫氧化銨溶液6 mL，加水至1000 mL，混勻，用甲酸調(diào)節(jié)pH 至3.5）為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0 ～15 min，75%A；15 ～30 min，75% ～20%A；30 ～31 min，20% ～75%A；31 ～40 min，75%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶劑的制備

取三氯化鐵適量，用超純水稀釋制成含三氯化鐵0.1 mg·mL－1的溶液，作為溶劑。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取依地酸二鈉適量，用超純水稀釋制成含依地酸二鈉100 μg·mL－1的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用溶劑稀釋制成含依地酸二鈉5 μg·mL－1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取供試品1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密量取不含依地酸二鈉的克林霉素磷酸酯注射液1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，得陰性樣品溶液。取空白溶液（溶劑）、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液和供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果空白溶液及陰性樣品溶液對(duì)依地酸二鈉測(cè)定無(wú)干擾，依地酸二鈉峰形良好，見(jiàn)圖1。

圖1 克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of disodium edetate in clindamycin phosphate injection

3.2 檢測(cè)限和定量限考察

取對(duì)照品溶液適量，用溶劑稀釋成含不同濃度依地酸二鈉的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，當(dāng)信噪比（S/N）＝3 時(shí)，依地酸二鈉濃度為0.03 μg·mL－1，為檢測(cè)限；當(dāng)S/N＝10 時(shí)，依地酸二鈉濃度為0.10 μg·mL－1，為定量限。

3.3 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用溶劑稀釋制成含依地酸二鈉0.10、0.50、1.01、3.02、5.04、6.05 μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣，以依地酸二鈉濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，按最小二乘法計(jì)算線性回歸方程，即Y＝2.60×104X－1.32×103，r＝0.998，結(jié)果說(shuō)明依地酸二鈉在0.10 ～6.05 μg·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.4 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，依地酸二鈉峰面積RSD為0.27%，說(shuō)明儀器精密度良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取供試品（批號(hào)：20063021）1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，作為供試品溶液，平行制備6 份，進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，供試品中依地酸二鈉含量的平均值為0.49 mg·mL－1，RSD為0.21%，說(shuō)明本方法具有良好的重復(fù)性。

3.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.4”項(xiàng)下供試品（批號(hào)：20063021）溶液，在室溫條件下保存，分別于0、4、8、16、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖中依地酸二鈉峰面積，結(jié)果對(duì)照品溶液中依地酸二鈉峰面積RSD為1.2%，供試品溶液中依地酸二鈉峰面積RSD為0.77%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫條件下48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 回收試驗(yàn)

以依地酸二鈉理論濃度為基準(zhǔn)100%，精密量取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1、5、6 mL 分別置于100 mL 量瓶中，再分別加入不含依地酸二鈉的克林霉素磷酸酯注射液1 mL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為20%、100%和120%的回收試驗(yàn)溶液，各濃度平行配制3 份。精密量取上述回收率溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。依地酸二鈉的回收率在98.4%～101.5%內(nèi)（n＝3），RSD為0.71%，表明本方法的回收率良好。

3.8 影響因素試驗(yàn)

對(duì)克林霉素磷酸酯注射液（批號(hào)：20063021）和按處方自制的克林霉素磷酸酯注射液（批號(hào)：DP6232）開(kāi)展影響因素試驗(yàn)，除去注射液的外包裝以及標(biāo)簽，考察高溫（60℃）和光照（光源強(qiáng)度5500 lux、近紫外燈能量85 μW·cm－2）對(duì)依地酸二鈉含量的影響。精密量取供試品1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，作為影響因素試驗(yàn)的供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算依地酸二鈉的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同考察條件下樣品中依地酸二鈉含量測(cè)定結(jié)果Tab 1 Content determination of disodium edetate under different investigation conditions

4 討論

4.1 溶劑的選擇

依地酸二鈉易與金屬元素螯合，直接進(jìn)樣依地酸二鈉時(shí)受色譜系統(tǒng)中金屬元素的影響主峰拖尾嚴(yán)重[6]。為改善主峰峰形，可先使依地酸二鈉與Fe3＋或Cu2＋離子形成穩(wěn)定的螯合物，再注入液相色譜系統(tǒng)。EDTA-Fe 螯合物與EDTA-Cu 螯合物相比，穩(wěn)定性更強(qiáng)，且所得色譜峰峰形更好，以EDTA-Fe 螯合物的形式檢測(cè)依地酸二鈉含量的方法更為常見(jiàn)[7-9]。當(dāng)溶劑中三氯化鐵質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1（摩爾濃度為0.6 mmol·L－1），可保證對(duì)照品溶液和供試品溶液中5 μg·mL－1的依地酸二鈉（摩爾濃度為0.015 mmol·L－1）全部轉(zhuǎn)化為螯合物。

4.2 耐用性討論

當(dāng)流動(dòng)相A 的pH 值為3.3 ～3.7，柱溫為25 ～35 ℃，流速為0.8 ～1.2 mL·min－1，依地酸二鈉峰形無(wú)明顯變化，且苯甲醇、克林霉素磷酸酯及其有關(guān)物質(zhì)對(duì)依地酸二鈉檢測(cè)無(wú)干擾，含量檢測(cè)結(jié)果與擬訂的色譜條件一致，說(shuō)明本方法具有良好的耐用性。待依地酸二鈉出峰后，流動(dòng)相中有機(jī)相比例逐漸升高至80%，確保供試品溶液中所有組分均被洗脫出色譜系統(tǒng)，防止殘留在色譜柱中影響后續(xù)樣品檢測(cè)。

4.3 影響因素試驗(yàn)結(jié)果討論

輝瑞和自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉的初始含量均為0.5 mg·mL－1，與處方量一致，換算成百分濃度為0.05%，在靜脈給藥輸液中的參考用量0.01%～0.075%[10]。高溫條件下，依地酸二鈉含量均無(wú)變化，預(yù)測(cè)在規(guī)定的貯藏條件下（遮光、密閉、陰涼），輝瑞和自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量均不會(huì)發(fā)生改變。光照條件下，依地酸二鈉含量均有所下降，但自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量降低速度更快。有文獻(xiàn)報(bào)道了元素雜質(zhì)在光照條件下催化依地酸二鈉降解[11-12]，因此推測(cè)自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量降低速度更快與自制藥液中元素雜質(zhì)的含量更高有關(guān)，有待進(jìn)一步證實(shí)。

本文建立的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量檢測(cè)方法方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法具有較好的專(zhuān)屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性等，同時(shí)該方法操作簡(jiǎn)便，適用于實(shí)驗(yàn)室的日常放行檢測(cè)。