兩廣地區地龍中22種無機元素量變規律研究

陳林明，林曉坤，王智民，楊群華，黃壽輝（廣州匯標檢測技術中心，廣州 510700）

地龍又名蚯蚓，始載于《神農本草經》，為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗環毛蚓Pheretima vu1garisChen、威廉環毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥體。前一種習稱“廣地龍”，后3 種習稱“滬地龍”。廣地龍春季至秋季捕捉，滬地龍夏季捕捉，及時剖開腹部，除去內臟和泥沙，洗凈，曬干或低溫干燥作即得地龍藥材[1]。

地龍藥用能清熱定驚、通絡、平喘、利尿，在臨床主要用于高熱神昏、驚癇抽搐、關節痹痛、肢體麻木、半身不遂、肺熱喘咳、水腫尿少等的治療[1]。現代研究表明，地龍具有抗凝血、促進創面愈合等作用，這與其含有的無機微量元素有關[2]。例如，硫化汞（HgS）就具有中樞神經抑制的藥理作用[3]。但隨著工業對土壤與水環境的重金屬污染加劇，地龍機體中富集的重金屬含量也增加，導致中藥地龍重金屬超標，使人體健康受到潛在威脅[4-5]。

目前，中藥無機元素含量研究集中在重金屬元素，然而，非重金屬元素的研究仍然偏少，各類藥材的無機元素研究仍不全面[6]。例如，二氧化硫的檢測研究較多，但對于硫元素檢測的報道則較少。此外，對于同一種藥材，因產地不同而其鉀含量存在著巨大差異，如菊花含鉀量在790 ～53 200 mg·kg－1[6]。因此，非重金屬元素的測定同樣具有現實意義。本研究采用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）對廣西、廣東地區地龍中22 種無機元素（5 種常量元素與17 種微量元素）進行測定，并對元素之間相關性及量變規律進行了分析，為中藥地龍的質量評價提供參考。

1 儀器與試藥

7900 型電感耦合等離子體質譜（美國安捷倫公司）；ETHOS UP 型微波消解儀（意大利Milestone 公司）；XPE26 微量天平、XS205DU電子天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）；DHG-9013A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒儀器有限公司）；KS-500E1 超聲波清洗機（福州瑞豪醫療器械有限公司）；Milli-Q 型超純水機（Millipore Bedford MA，美國）；TH-Ⅱ型數控薄層顯色加熱器（上海科哲生化科技有限公司）。

Multi Element Standards 2A 27 種標準溶液包含Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn（部件號8500-6940，美國Agilent公司，質量濃度10 mg·L－1）；SPEXertificate 9 種標準溶液包含Mo、Pd、Re、S、Sb、Si、Sn、Ti、W（批號：1-194AB）、SPEXertificate 20 種標準溶液包 含B、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W（批號：2-192AB）（美國SPEX 公司，質量濃度1000 μg·mL－1）；內標溶液：73Ge（批號：GSB04-1728-2004）、115In（批號：GSB04-1731-2004）、209Bi（批號：GSB04-1719-2004）的單元素標準溶液（1000 μg·mL－1，中國計量科學研究院國家標準物質研究中心）；色譜級硝酸（Fisher scientific 公司）；高純氬氣（福州聯創特種氣體有限公司）。

30 份樣品（編號為S1 ～S30）均于2020年5月購自藥材市場，其中S1 ～S14 產于廣東省，S15 ～S30 產于廣西壯族自治區。所有樣品由福建中醫藥大學藥學院楊成梓副教授鑒定為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）的干燥體（習稱“廣地龍”）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品與空白溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.5 g（過5 號篩）于微波消解罐中，加硝酸8.0 mL，放置過夜，按操作規程進行消解處理：先經10 min 由室溫升溫至130 ℃，并維持5 min 消解，再10 min 由130℃升溫至165℃，并維持10 min 消解，然后15 min 由165℃升溫至180 ℃，并維持30 min 消解。消解完畢后，放冷，取出消解罐置于加熱板上將酸揮盡，冷卻后將消解液轉移至50 mL 量瓶，并洗滌消解罐3 次，洗液合并至量瓶中，用超純水定容后搖勻，即得供試品溶液。同法同步制備試劑空白溶液試驗。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密量取Si、S、Ti、W、Pb 的混合對照品母液，標記為混標1；精密量取元素Li、Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba 的混合對照品母液，標記為混標2，用5%HNO3把混標1 和混標2 稀釋成5、10、20、50、100 μg·mL－1的混合對照品。

2.2 測定條件

質譜條件：儀器自動調諧設定工作參數，以靈敏度、背景、穩定性等各項指標對儀器的工作參數進行優化。測定條件：等離子射頻功率1550 W，等離子氣體15 L·min－1，輔助氣體流量1 L·min－1，霧化氣流量1 L·min－1，補償/稀釋氣體1 L·min－1，霧化室溫度2℃，蠕動泵速度0.3 r·min－1。積分時間1 s，延遲時間1 s，重復次數3 次；測量方式：標準曲線法；讀數方式：峰強。以73Ge、115In、209Bi 為內標。

2.3 標準曲線的制備

根據試樣中待測元素的水平配制標準溶液，依次測定20 種無機元素的系列質量濃度標準溶液，加入73Ge、115In、209Bi 內標溶液，同法配制標準空白溶液。Li、Na、Mg、Al、Si、S、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr 以73Ge 為內標，Cd、Ba 以115In 為內標，W、Pb 以209Bi 為內標。以對照品質量濃度為橫坐標（X），以待測元素與相應內標計數值的比值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。計算各元素標準品的回歸方程、相關系數和線性范圍。結果各元素在0 ～100 μg·L－1與測定值線性關系良好，在測各元素時，記錄測量11 次空白溶液所產生的信號值，計算標準偏差，以3 倍標準偏差時的濃度作為檢測限，詳見表1。

表1 22 種無機元素的線性回歸方程，相關系數，檢測限和線性范圍Tab 1 Linear regression equation，relevant coefficient，detection limit and linearity for 22 elements

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取混合對照品溶液連續進樣6 次，22 種無機元素的RSD值在1.2%～3.0%，表明儀器的精密性良好。

2.4.2 重復性試驗 精密稱取樣品（S13）6 份，制成供試品溶液，測定22 種元素的含量。除Li、Cr、Ni 未檢出，Na、Mg、Al、Si、S、K、Ca、Ti、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W、Pb 的含量均值分別為0.76、0.69、0.57、0.06、7.96、9.87、0.13、0.01、0.02、0.87、0.01、0.23、0.02、0.01、0.01、0.01、0.02、0.02、16.22 mg·kg－1，對應RSD值均在1.6%～3.0%，說明方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取樣品（S13）1 份，制成供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h測定22 種元素的含量。除Li、Cr、Ni 未檢出，其余元素的RSD值均在1.3%～2.5%。表明待測溶液在24 h 內穩定。

2.4.4 加樣回收試驗 精密稱取已測定的地龍樣品（S13）6 份，每份0.5 g，精密加入一定量的各元素的標準溶液，測定其含量，計算22 種元素的回收率。除Li、Cr、Ni 未檢出，其余元素回收率分別在98.7%～103.3%，RSD值均在1.5%～2.7%。

2.5 樣品含量測定

按“2.1”項下方法制備各地龍樣品的供試品溶液，按“2.2”項下條件測定各樣品中22 種無機元素的含量。30 份地龍樣品中22 種無機元素的含量見表2。

3 結果與分析

3.1 直觀分析

由表2 可知，部分元素含量差別較大。在30 份樣品中，3 種元素Li、Cr、Ni 均未檢出，5種元素Ti、Cu、As、Sr、Cd 未檢出樣品占全部樣品的比率分別約為40%、13%、17%、23%、47%。另外，僅有2 份樣品含有W。根據現行《中國藥典》對地龍規定的部分重金屬元素限量標準：重金屬總量（以Pb 計）不得過30 mg·kg－1，由表2 可見，有33.3%的樣品Pb 超標，同時Pb 是所有樣品中被測元素含量最高的元素，說明廣地龍生長環境存在Pb 污染情況，這可能與兩廣地區電鍍、印染等工業發展有關。

表2 廣地龍22 種元素的含量(mg·kg－1)Tab 2 Content of 22 elements in pheretima (mg·kg－1)

3.2 Mann-Whitney U 檢驗分析

由于數據屬于非正態分布，在SPSS 23.0 統計軟件中，采用Mann-Whitney U 檢驗分析廣東、廣西地龍中各元素含量的差異。結果顯示，廣東、廣西地龍中Pb、Sr、Zn 含量有明顯差異（P＜0.05），兩地的地龍所含其他19 種元素含量無顯著性差異。

3.3 廣地龍無機元素特征圖譜分析

根據定量測定的元素結果，將30 份樣品的22 種元素按原子序數順序制作含量分布曲線，形成廣地龍元素指紋圖譜。由圖1 可知30 份樣品呈現相似的峰形，且各元素含量分布呈現規律性的波動。顯然，地龍所含S、K、Pb 元素含量較高，其中含S 較多可能是由于地龍含有許多帶二硫鍵的核酸酶樣蛋白，例如EWD1、EWD2 等，這些多肽類成分具有良好的抗纖維化作用[7]；但地龍中含Pb 量最高，值得相關養殖企業關注。

圖1 廣地龍22 種元素指紋圖譜Fig 1 Fingerprint of 22 elements in pheretima

3.3 主成分分析

把30 份樣品的結果代入SIMCA 14.1 軟件中，點擊“summary of fit”，得到2 個主成分，其中R2X 為0.43，Q2為0.125，表明當前2 個主成分的模型預測能力較差，故不進一步分析各主要成分解析表達式與各樣品的主成分綜合得分。點擊“scores”得到主成分得分圖（見圖2），可以看出樣品S14 是PCA 分析中的異常點，此外，來自廣東的地龍S1 ～S13（Group 1）基本與主成分t[2]成正相關，而來自廣西的地龍S15 ～S30（Group 2）則成負相關，即PCA 能夠區分兩個地區的地龍。點擊"loadings"，系統自動剔除Li、Cr、Ni（均未檢出）與W（所有樣品中僅2 份樣品有檢出，數據缺乏整體代表性），得到加載散點圖（見圖3），18 種元素分布于區間p[1]－0.2 ～0.5，p[2]－0.3 ～0.4，說明18 種無機元素的分布基本呈均勻分散。

圖2 30 批樣品在元素含量主成分的分布圖Fig 2 Distribution of 30 batch samples in principal components of elements’ contents

圖3 22 種元素加載散點圖Fig 3 Loading scatter plot for 22 elements

3.4 聚類分析

數據導入SPSS 軟件，平方歐氏距離法，得到系統聚類分析結果，如圖4 所示。所有樣品被分成兩大類，樣品S1 ～S12 及S15 聚成一大類（Group 1），剩余樣品聚成另一大類（Group 2）。在Group 1 中，樣品S1 ～S12 均來自廣東，僅S15 來自廣西類似地，在Group 2 中絕大部分樣品來自廣西。說明系統聚類分析無法100%區分廣東和廣西地龍；但從22 種無機元素含量角度可發現廣東、廣西地龍之間整體存在明顯的差異。具體臨床療效是否存在差別還有待后期深入研究。

圖4 所有樣品聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis for all samples

3.5 相關性分析

除去Li、Cr、Ni（未檢出），對所有樣品的剩余19 種元素含量進行Person 相關性分析，結果表明，Al、Cu、Fe、Ti 互成正相關（P＜0.01），此外成正相關的還有：As 與Zn；Ba 與Ca、Sr；Ca 與Sr；Cu 與Sr（P＜0.01）；Al 與Mg；Ba 與Cu、Pb、W；Ca 與Mn；Cd 與K、Se；Cu 與Na；Fe 與Mg；K 與Na；Mg 與Na；Pb 與Sr、Zn；Sr 與W、Zn（P＜0.05）。成負相關的有：Al 與Zn；K 與Mn；Mg 與Pb（P＜0.05）；Mg 與Ti（P＜0.01）。

4 討論

本研究所測22 種元素中，5 種為常量元素（Na、Mg、S、K、Ca），其余17 種為微量元素。其中，人體必需微量元素有6 種：Fe、Cu、Zn、Se、Cr、Sr，非必需微量元素有4 種：Ba、Ti、Li、W，可能必需微量元素有3 種：Mn、Si、Ni，有害元素有4 種：As、Cd、Pb、Al。參照《中國居民膳食營養素參考攝入量第2 部分：常量元素》（WST 578.2—2018）標準，所測30 批地龍樣品中，5 種常量元素含量均符合規定。參照《中國居民膳食營養素參考攝入量第3 部分：微量元素》（WS/T 578.3—2017）標準，所測30 批地龍樣品中，6 種人體必需微量元素含量均符合規定。4 種非必需微量元素的人體正常攝入值暫無標準可依。30 批樣品中有害元素As、Cd 的含量均遠低于《中國藥典》2020年版（四部9302 中藥有害殘留物限量制訂指導原則）規定限量值[8]，但Pb含量均超標1 ～8 倍，提示地龍養殖環境存在Pb污染。1989年，世界衛生組織把Al 列為食品污染源之一，建議每日Al 攝入量應控制在4 mg 以下，過多攝入會損害腦細胞，30 批樣品中Al 元素含量均低于3 mg·kg－1，相對安全。

30 批樣品中，除Pb、Al 外，S、Ka、Fe、Zn含量較高。其中，生物體內S 元素是某些蛋白的關鍵元素，有助于人體軟組織損傷的再生修復[9]。地龍富含有一種特殊物質：金屬硫蛋白，該蛋白含量高會使S 含量變高[7]。目前普遍認為K 對人體有益，但過量攝入會導致心腎功能障礙[10]。研究表明，胎菊、北板藍根、蟬蛻等藥材含K 超過3000 mg·kg－1，可能與土壤使用鉀肥有關。本研究所測地龍含K 量均低于15 mg·kg－1（遠低于3000 mg·kg－1），因此相對安全。Fe 元素是血紅蛋白的重要組成成分，主要用于氧氣的運輸，地龍Fe 含量高利于其發揮通絡之功效。研究表明，Zn 元素利于傷口愈合，其加速創面愈合功效可能與地龍含較多Zn 有關[10-11]。

本研究發現，主成分分析能夠區分廣東、廣西地區的地龍，這與聚類分析結果一致，說明兩廣地區的地龍在整體上存在無機元素含量的差異。根據Mann-Whitney U 檢驗分析結果可知，該差異主要是由于兩個地區地龍中Pb、Sr、Zn含量均存在顯著差異所致。且相關性分析結果顯示Pb、Sr、Zn 元素的含量互成顯著正相關。文獻報道，廣地龍對Zn、Pb 具有較強的生物富集作用[11]。類似地，曾林等[12]用不同Pb 質量分數濃度的土壤馴養地龍，發現地龍對Pb 的富集量隨時間的增加。綜上可以推測，兩廣地區生態環境中Pb、Sr、Zn 元素的含量存在顯著差異；同時，地龍對這3 種元素具有較強地生物富集作用。

廣地龍的主產區如廣州、玉林等地，其土壤、水質均存在不同程度的隱性重金屬污染[13]。地龍獨特的生活習性，使其極易受到土壤環境的影響，尤其是對部分重金屬具有自然富集作用，對人體可能存在潛在健康威脅。但有研究證明，地龍中有害元素的風險并不完全取決于有害元素的總量，而是取決于各元素在機體中化合的價態[14]。然而，機體中金屬元素的結合狀態大多數是未知的，因此只有對其進行結合態以及結合物的毒理研究，才能做出準確的風險評估。目前，只能從養殖方面入手，加強土壤、水質、飼料管理，盡量減少地龍的重金屬污染。