阿膠強骨口服液對大鼠缺鐵性貧血的改善及其對鐵代謝的調節作用機制初探

恰木斯亞·吐爾遜哈里，美拉依·吉恩斯，武嘉林，2*（. 新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊 8300；2.新疆華世丹藥業股份有限公司，烏魯木齊 8300）

貧血影響著全球大約30%的人們的健康，其中有50%是由缺鐵引起的[1]。缺鐵性貧血（IDA）是由于鐵攝入不足、吸收不良、轉運受損、利用障礙等原因引起的機體鐵缺乏，導致人體血液中紅細胞生成減少而引起的貧血，在經濟不發達地區的嬰幼兒、育齡婦女中多發[2]?？诜F劑是最常見的治療缺鐵性貧血的手段，但近幾年報道口服鐵劑不良反應較多，例如水溶性差、生物利用率低，導致過量的游離鐵進入體內，刺激胃腸道引起惡心、嘔吐、腹部不適等，且過量補鐵造成鐵超載的同時會引發肝臟、心血管的損傷和神經退行性病變[3]。因此近年來毒副作用較低、作用溫和、多成分的中藥補鐵劑在臨床應用中凸顯其優勢。

阿膠強骨口服液是由熟地、阿膠、黃芪等中藥組成，依據傳統中醫學理論，具有補益肝腎、填精壯骨、生血扶正等功效。前期研究[4-6]發現其對貧血有一定療效，以往研究多集中在阿膠強骨口服液的含量測定、質量標準研究等方面，未見其對缺鐵性貧血及鐵代謝影響的研究。本實驗擬研究阿膠強骨口服液對大鼠缺血性貧血的改善作用并初步探討其對鐵代謝的調節作用，為阿膠強骨口服液應用于臨床治療缺鐵性貧血提供實驗依據。

1 材料

1.1 試藥

阿膠強骨口服液（新疆華世丹藥業股份有限公司，規格：10 mL/支，批號：2019111802）；硫酸亞鐵（山西力玖藥業有限公司，批號：180319）；復方阿膠漿（山東東阿阿膠股份有限公司，批號：1806027）；低鐵飼料（睿迪生物科技深圳有限公司，批號：18073112，含鐵量6.7 mg·kg－1）；膜鐵轉運蛋白（FPN-1）酶聯免疫分析試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：20200517）；二價金屬轉運蛋白（DMT-1）酶聯免疫試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：20210518）。

1.2 動物

SPF 級健康雄性SD 大鼠60 只，體質量180 ～200 g [新疆醫科大學實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（新）2018-0002]，飼養于新疆醫科大學動物中心SPF 級屏障環境，維持室溫在（24±2）℃，濕度 50%～60%，采用12 h 晝夜節律 7：00 ～19：00 飼養。

1.3 儀器

分析天平（FA104，上海恒平科學儀器有限公司）；ABM 型小動物麻醉機（異氟醚，上海玉研科學儀器有限公司）；全自動生化分析儀（750型，日本光學株式會社）；酶標儀（Model 680，美國伯樂公司）；臺式冷凍高速離心機（5417R，德國EPPENDORF 公司）。

2 方法

2.1 IDA 大鼠模型的建立

60 只雄性SD 大鼠適應性喂養5 d 后，隨機分為正常對照組（8 只）和造模組（52 只）。根據文獻[7]方法加以改進，模型組飼喂低鐵飼料、飲用去離子水，每隔3 d 耳緣靜脈放血1 mL。依據查閱的相關研究及臨床鑒定標準，血紅蛋白（HGB）＜90 g·L－1，符合輕度缺鐵性貧血判斷標準，表明造模成功。正常對照組投喂正常飼料并給予自來水，每周稱重并記錄體質量。造模28 d 后采血進行分析，檢測實驗大鼠HGB。

2.2 分組與給藥

2.2.1 動物分組 造模過程中死亡4 只，造模成功的模型大鼠隨機分為6 組：模型對照組，硫酸亞鐵組（陽性藥物組），復方阿膠漿組，低、中、高劑量阿膠強骨組，每組8 只。

2.2.2 給藥

① 硫酸亞鐵組：灌胃硫酸亞鐵混懸液5 mL·kg－1及去離子水10 mL·kg－1（臨床用量：成人每日3 片，規格：含鐵60 mg/片，按動物與人體質量比折算，以成人60 kg 計，大鼠的等效劑量為5 mL·kg－1）。

② 復方阿膠漿組：6.3 mL·kg－1灌胃給藥（臨床用量：每日20 mL/支，按動物與人體體質量比折算，以成人60 kg 計，大鼠的等效劑量為6.3 mL·kg－1）。

③ 阿膠強骨口服液組：低、中、高劑量分別為3.15、6.3、12.6 mL·kg－1灌胃給藥（臨床用量：每支10 mL，每日3 支；按動物與人體體質量比計算，以成人60 kg 計，大鼠的等效劑量為3.15 mL·kg－1設為低劑量，中劑量為2 倍即6.3 mL·kg－1，高劑量為4 倍即12.6 mL·kg－1）。

造模完成后，各給藥組均連續灌胃28 d，每隔3 d 稱體質量，并拍照觀察狀態。灌胃給藥期間各藥物組、模型對照組飼喂低鐵飼料，防止外源性鐵的攝入，正常對照組則給予正常飼料。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠體質量及臟器系數測定 各組動物末次給藥后，禁食12h，稱重記錄末次體質量。完成取血后，脫頸椎處死大鼠，并解剖剝離心臟、肝臟、脾臟，并稱量各臟器質量。臟器系數即為各臟器質量/大鼠體質量。

2.3.2 血常規檢測 造模28 d 后所有大鼠眼眶取血置含抗凝劑 EDTA-2K 的EP 管中，用于血常規分析。各組動物末次給藥后，禁食12 h。大鼠麻醉后頸動脈取血1 mL 置含抗凝劑 EDTA-2K 的EP管中，用于血常規分析。

2.3.3 血生化檢測 采集的血液放置在37 ℃培養箱1 h，冰箱4℃過夜，3000 r·min－1離心20 min，吸取上清液，測定血清鐵（SI）。

2.3.4 鐵代謝相關蛋白檢測 采用ELISA 法檢測大鼠DMT-1、FPN-1。取各組大鼠十二指腸同一部位，切割標本后，稱取質量。加入一定量的PBS 后用手動勻漿器勻漿，充分離心后收集上清液。嚴格按照試劑盒操作步驟進行檢測，計算出各給藥組蛋白含量。

2.4 統計學方法

數據使用 SPSS 21.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較用SNK 法；多組不符合正態性比較采用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 阿膠強骨口服液對缺鐵性貧血大鼠體質量及臟器指數的影響

大鼠體質量及各臟器指數如表1 所示，模型對照組大鼠體質量較正常對照組顯著降低（P＜0.01），各藥物組補鐵后大鼠體質量回升，但差異無統計學意義。肝臟是最重要的儲鐵器官之一，而鐵主要以鐵蛋白和含鐵血黃素形式存在于此[8]。與模型對照組比較，補鐵后各組大鼠肝臟指數、脾臟指數和心臟指數差異均無統計學意義。

表1 阿膠強骨口服液對缺鐵性貧血大鼠體質量及臟器指數的影響( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on body mass and organ index in rats with iron deficiency anemia ( ±s，n ＝8)

表1 阿膠強骨口服液對缺鐵性貧血大鼠體質量及臟器指數的影響( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on body mass and organ index in rats with iron deficiency anemia ( ±s，n ＝8)

注（Note）：與正常對照組比較，##P ＜0.01（Compared with the normal control group，##P ＜0.01）。

組別體質量/g肝臟指數/%脾臟指數/%心臟指數/%正常對照組416.00±25.072.67±0.080.19±0.040.33±0.04模型對照組394.70±61.58##2.40±0.230.20±0.040.35±0.06硫酸亞鐵組395.20±43.202.26±0.420.23±0.070.32±0.03復方阿膠漿組385.60±43.202.21±0.210.23±0.040.32±0.04阿膠強骨口服液低劑量組408.90±30.572.33±0.310.24±0.050.36±0.05阿膠強骨口服液中劑量組407.30±46.282.42±0.270.25±0.060.32±0.04阿膠強骨口服液高劑量組409.90±43.862.37±0.340.24±0.040.36±0.05

3.2 阿膠強骨口服液對大鼠血常規的影響

造模28 d 后進行血常規檢測，結果如圖1 所示。與正常對照組比較，模型對照組大鼠HGB下降[（179.00±8.60）vs（78.29±8.60）g·L－1，P＜0.05]。依據臨床鑒定標準，HGB 低于90 g·L－1，符合輕度缺鐵性貧血模型評價標準[9-15]。且模型對照組較正常對照組紅細胞數（RBC）、紅細胞比容（HCT）、紅細胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞平均體積（MCV）差異均有統計學意義（P＜0.05），說明造模成功。

圖1 大鼠造模完成時血常規變化Fig 1 Blood routine indicators at the completion of modeling in rats

藥物干預28 d 后測試各組大鼠血常規指標。由圖2 可知，各組HGB 值均不同程度的增加，阿膠強骨口服液低、中、高劑量組較模型對照組HGB（91.0±6.98）g·L－1分別增加到（127.8±7.33）、（131.0±9.67）、（131.4±8.33）g·L－1；HCT 較模型對照組（26.05±1.64）%分別增加到（32.78±1.60）%、（35.2±3.73）%、（33.5±2.02）%。HGB 減少是缺鐵性貧血的主要表現形式之一[16-17]。臨床上紅細胞MCH 和MCV下降多見于缺鐵性貧血[18]。由圖2 可知，在給藥期內所有實驗組大鼠的MCH 值和MCV 值均明顯高于模型對照組（P＜0.05）；且阿膠強骨口服液各劑量組均趨于正常。

圖2 阿膠強骨口服液對缺鐵性貧血大鼠血常規影響Fig 2 Effect of Ejiao Qianggu oral solution on blood routine examinationin rats with iron deficiency anemia

3.3 阿膠強骨口服液對大鼠血清鐵及DMT-1、FPN-1 蛋白的影響

SI 含量檢測結果如圖3 所示，與正常對照組比較，模型組SI 含量顯著降低；與模型對照組比較，阿膠強骨口服液中、高劑量組SI 顯著升高（P＜0.05），提示阿膠強骨口服液能增加SI 含量。

圖3 阿膠強骨口服液對大鼠SI 及DMT-1、FPN-1 蛋白的影響Fig 3 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on the serum iron，DMT-1 and FPN-1 proteins in rats

大鼠十二指腸DMT-1、FPN-1 蛋白含量測定結果如圖3 所示。DMT-1 蛋白測定中阿膠強骨中、高劑量組較模型對照組顯著升高（P＜0.01），提示阿膠強骨口服液顯著增強缺鐵性貧血大鼠十二指腸DMT-1 蛋白的表達。FPN-1 蛋白測定中阿膠強骨口服液高劑量組與模型對照組顯著升高（P＜0.01），提示阿膠強骨口服液高劑量組能顯著增強缺鐵性貧血大鼠十二指腸FPN-1 蛋白的表達。

4 討論

4.1 阿膠強骨口服液藥理作用分析

HGB 又稱血色素，是紅細胞的主要組成部分，能與氧結合，運輸氧和二氧化碳。HGB 變化的臨床意義基本和紅細胞計數的臨床意義相似，HGB 能更好地反映貧血的程度[19-20]。本實驗結果顯示阿膠強骨口服液能增加HGB 含量，且效果與陽性藥物相當，又能增加HCT、MCH、MCHC、MCV 含量。模型對照組紅細胞數較造模完成時略有增加，可能與貧血模型大鼠長期缺氧（HGB 含量低，貧血），機體代償性增加紅細胞數量有關。鐵是構成HGB 的一種重要組成部分，為機體的必需微量元素之一，參與機體的生命活動。鐵離子的主要轉運形式是SI 與轉鐵蛋白結合[21-23]。阿膠強骨口服液能增加SI 含量且與給藥劑量呈線性遞增關系。食物中的鐵離子主要經腸上皮細胞表達的DMT-1 和FPN-1 進入血液[24]。DMT-1 在各組織中都有分布，但是在近端小腸表達最高[25]。FPN-1 作為跨膜鐵輸出蛋白，主要在十二指腸絨毛上皮細胞的基底端和基底膜分布，將腸細胞內的鐵離子轉運出細胞，進入血液[26]。基于此本研究選擇了具有代表性的以上兩種蛋白，結果阿膠強骨口服液能增加大鼠十二指腸DMT-1 和FPN-1 蛋白含量，推測阿膠強骨口服液通過上調DMT-1 和FPN-1 來促進十二指腸對鐵的吸收，增加SI 含量，促進HGB 合成。

4.2 阿膠強骨口服液組方規律分析

阿膠強骨口服液由熟地、阿膠、枸杞、黃芪、黨參、牡蠣等組成，依據“氣血互生、氣升血長”的傳統中醫學理論加味而成。

君藥熟地補血滋陰，益精填髓。研究表明熟地黃內含梓醇、糖類、氨基酸、地黃苷以及多種微量元素，可增強人體免疫力，促進造血。相關藥理實驗研究顯示熟地黃水提物可增加實驗鼠骨髓造血干細胞以及祖細胞的增殖分化過程，能夠加速增加HGB，加速造血功能恢復[27-28]。

臣藥阿膠補血滋陰，潤燥，止血。阿膠含有多種氨基酸和微量元素，有增強免疫、促進造血功能、促進骨愈合等作用。現代藥理學研究發現阿膠能夠治療貧血，且不影響鐵儲備[29]。阿膠中的甘氨酸成分可調節SI 以發揮加快血液合成HGB 速度，控制缺鐵性貧血[30]。相關臨床實踐研究證明中藥阿膠在刺激機體紅細胞與HGB 再生功能方面的療效遠遠高于鐵劑，故多被應用于血小板減少、白細胞減少癥以及缺鐵性貧血癥[31-32]。本次實驗研究也表明阿膠強強骨口服液能顯著增加大鼠SI 含量、HGB 含量，與臨床上眾多學者的研究結果相同[33]。

佐藥黃芪補氣升陽，生津養血。黨參具有健脾益肺、養血生津之功效，用于脾肺氣虛、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短等癥，具有增強造血功能、調節血壓等功效，臨床上可用于防治高血脂癥、低血壓、造血功能障礙[34]。牡蠣重鎮安神、潛陽補陰、軟堅散結。牡蠣咸寒、斂陰止汗，黃芪性溫、補氣益損，兩者配伍，一補一澀，陰陽兼顧，共俱補虛止汗之功，陰陽氣血不足多用此兩味。臨床對于懷孕婦女及小兒鈣質缺乏等有效[35-37]。

傳統中醫理論認為熟地、阿膠、黃芪、黨參四味藥配伍具有補血補氣、補精填髓的功效，由此推測阿膠強骨口服液中補血生血的藥味主要是熟地、阿膠，其次是黃芪與黨參。整個組方君臣佐使分明，依據傳統中醫理論多角度、多靶點治療貧血，方中各藥味協同使用可氣血雙補。

綜上所述，阿膠強骨口服液能有效改善大鼠缺鐵性貧血、促進鐵代謝，其作用機制與腸道鐵轉運相關的DMT-1、FPN-1 蛋白密切相關。相對陽性對照（硫酸亞鐵補鐵組）并未出現不良反應。阿膠強骨口服液中具體何種物質治療貧血則有待進一步深入研究，本結果有望為開發一種新的治療缺鐵性貧血的藥物提供實驗依據。