呋塞米雜質(zhì)B的潛在毒性預測研究

姜宏宇，王翰洵，王健*（. 沈陽藥科大學制藥工程學院，沈陽 006；2. 東北制藥集團股份有限公司，沈陽 0027）

呋塞米（furosemide）， 化學名稱為4-氯-2-[（2-呋喃甲基）氨基]-5-磺酰氨基苯甲酸，是一種強效速效類利尿藥，通過抑制腎小管髓袢升支粗段對NaCl 的主動重吸收，排出大量接近于等滲的尿液[1]。呋塞米主要用于各種水腫，且能預防腎功能衰竭，對高血壓也有一定治療效果[2]。

呋塞米的制備過程中，以2，4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸為原料，在堿性條件下形成鈉鹽后，和糠胺于130℃反應生成呋塞米鈉鹽（見圖1）。再經(jīng)過乙醇精制后，酸化得到呋塞米。但是該工藝制備的呋塞米粗品會生成微量雜質(zhì)2-氨基-5-氨磺酰基-4-氯苯甲酸（美國藥典雜質(zhì)B，歐洲藥典雜質(zhì)C，本文簡稱雜質(zhì)B，見圖2）。在原料糠胺的制備中，常用到甲醇的氨溶液，且氨分子在糠胺精制過程中因溶解度高，沸點低而難以被徹底除去，因此氨分子作為糠胺中的雜質(zhì)被帶入到呋塞米的合成中。在呋塞米的合成過程中，堿性條件下羧酸基團的氫離子被電離，產(chǎn)生負電中心，對糠胺和氨分子均具有位置限定作用，另外，磺酰胺基和羧基的鈍化作用使得羧基的臨位氯容易離去。這些因素導致雜質(zhì)B 不可避免地出現(xiàn)在產(chǎn)物中。另一方面，呋塞米結構穩(wěn)定性較差。在貯存、制劑生產(chǎn)過程中，呋塞米受到光照、加熱及酸性等條件易被降解成產(chǎn)物B，因此呋塞米應在避光，陰涼處保存，同時對該降解雜質(zhì)的檢測方法也有大量報道[3-5]。相比于其他僅在生產(chǎn)和貯存過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)[如2，4-二氯-5-氨磺酰基苯甲酸、2-氯-4-（2-糠氨基）-5-氨磺酰基苯甲酸、2，4-雙（2-糠氨基）-5-氨磺酰基苯甲酸等]，呋塞米在進入體內(nèi)后，雜質(zhì)B 也作為人類體內(nèi)代謝產(chǎn)物出現(xiàn)[6-7]。該雜質(zhì)在體內(nèi)可能會與某些蛋白靶標發(fā)生結合，進而引發(fā)藥品的不良反應[8]。

圖1 呋塞米的工業(yè)合成路線Fig 1 Industrial synthetic route of furosemide

本文通過計算化學方法，預測該雜質(zhì)的潛在毒性，為藥物雜質(zhì)研究提供新的視角。

1 儀器與試藥

BT-25S 電子天平（賽多利斯）；Milli-Q Advantage 純水儀（美國 Millipore 公司）；呋塞米、呋塞米相關物質(zhì)B [純度均為98%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]。

2 方法

2.1 雜質(zhì)B 與呋塞米的結構相似性分析

雜質(zhì)B 與呋塞米的結構分析通過Forge 軟件進行，將兩個化合物的結構轉變?yōu)槿S空間結構，并導入Forge 進行構象搜索和柔性疊合，根據(jù)力場特征進行相似性分析。

2.2 雜質(zhì)B 的靶標預測

將雜質(zhì)B 的結構，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中進行結構相似性檢索，選擇蛋白-配體共結晶中配體與雜質(zhì)B 具有最大相似性的蛋白靶標。根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的以配體結構相似性排序方法，將檢索結果排名由高到低排序，確定前三個蛋白為雜質(zhì)B 最為可能的潛在蛋白靶標。

2.3 雜質(zhì)B 與靶標作用方式分析

通過Glide 程序?qū)㈦s質(zhì)B 與預測的靶標進行分子對接，分析其作用方式。通過分子動力學程序Desmond，研究蛋白-化合物復合物在溶液狀態(tài)下的動態(tài)過程。提取分子動力學軌跡文件，分析雜質(zhì)B 在蛋白質(zhì)活性位點的結合方式和親和力。

2.4 雜質(zhì)B 的ADME/Tox 性質(zhì)預測

通過SWISSADME 在線程序（http：//www.swissadme.ch/）預測雜質(zhì)B 的吸收、分配、代謝、排泄或毒性（ADME/Tox）性質(zhì)。SWISSADME通過已有的毒性或藥代動力學經(jīng)驗模型對給定的小分子進行計算，并給出模型預測的可能結果。

2.5 生物學實驗

在37℃，將THLE-2 細胞在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育（Thermal Fisher Scientific）。培養(yǎng)基采用 DMEM（Biological Industries），并添加10%FBS（Biological Industries，Certified Foetal Bovine Serum）和1%青霉素-鏈霉素雙抗（Biological Industries）。在96 孔板中加入不同濃度的雜質(zhì)B，將對照細胞用賦形劑處理，孵育2 h。加入MTT 溶液（0.5 mg·mL－1）（Beyotime，ST1537）并孵育4 h 加入結晶紫溶液（Beyotime，C0121），使用酶標儀在492 nm 下測量吸光度。

3 結果

3.1 雜質(zhì)B 與呋塞米的結構相似性比較

通過比較雜質(zhì)B 與呋塞米的結構，可以發(fā)現(xiàn)二者在結構上具有很大的相似性，都具有電負性基團，而且兩者在理化性質(zhì)上也有較高的相似性，這揭示雜質(zhì)B 與呋塞米可能會被同類型的蛋白靶點識別。相比于呋塞米，缺少了親酯呋喃環(huán)的雜質(zhì)B，分子量和SlogP值相對呋塞米均有顯著的下降，但拓撲極性表面積（TPSA）未有明顯改變。由兩個分子的分子場疊合圖可以看出兩個分子除N-甲基呋喃側鏈以外的特征極為相似（見圖2）。

圖2 雜質(zhì)B 與呋塞米結構相似性比較Fig 2 Structural similarity between impurity B and furosemide

3.2 雜質(zhì)B 的潛在靶點

在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)雜質(zhì)B 的結構式檢索，發(fā)現(xiàn)有三個蛋白質(zhì)可能會識別雜質(zhì)B（見表1）。

表1 雜質(zhì)B 潛在靶點Tab 1 Potential targets of impurity B

3.3 雜質(zhì)B 與潛在靶點的作用方式分析

通過分子對接和分子動力學模擬研究，預測雜質(zhì)B 與三個靶蛋白在生理條件下的動態(tài)結合方式，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B 與這三個靶點結合的可能性較高。其中，雜質(zhì)B 與碳酸酐酶的鋅離子形成配位鍵，與His64、Hid94、Glu106 和Thr199 形成氫鍵（見圖3）；與甲狀腺素結合球蛋白Asn278 和Arg301形成氫鍵（見圖4）；雜質(zhì)B 與巨噬細胞抑制因子Pro1，Met2 和Asp92 形成氫鍵（見圖5）。由此推斷，雜質(zhì)B 可能會對以上三個蛋白具有調(diào)節(jié)活性。本研究發(fā)現(xiàn)其中一個靶點碳酸酐酶2 本身是呋塞米的作用靶點，因而推測雜質(zhì)B 具有和呋塞米類似的利尿活性。此外，預測得到的靶點甲狀腺素結合球蛋白，其生物學功能與甲狀腺機能亢進相關，可以推測呋塞米雜質(zhì)也可能具有類似不良反應。

圖3 雜質(zhì)B 與碳酸酐酶2（PDB 編號：1Z9Y）的結合方式Fig 3 Binding pattern of impurity B with carbonic anhydrase Ⅱ protein pocket（PDB code 1Z9Y）

圖4 雜質(zhì)B 與甲狀腺素結合球蛋白（PDB 編號：2XN5）的結合方式Fig 4 Binding pattern of impurity B with thyroxine-binding globulin protein pocket（PDB code 2XN5）

圖5 雜質(zhì)B 與巨噬細胞抑制因子（PDB 編號：3RF4）的結合方式Fig 5 Binding pattern of impurity B with macrophage migration inhibitory factor protein pocket（PDB code 3RF4）

3.4 雜質(zhì)B 與呋塞米的ADME/Tox 預測

通過Swiss ADME prediction 網(wǎng)站，預測雜質(zhì)B 與呋塞米的ADME/Tox 的性質(zhì)，結果發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B 與呋塞米除不飽和以及極性兩項偏離模型外其他性質(zhì)良好。對比呋塞米，該雜質(zhì)體現(xiàn)出相似的成藥性特征，有較好的腸道透過性，且不易被P-gp 蛋白作為底物排出細胞，因此可以認定兩者性質(zhì)相似（見圖6）。

圖6 雜質(zhì)B 與呋塞米的ADME/Tox 性質(zhì)預測Fig 6 Prediction of ADME/Tox properties for impurity B and furosemide

3.5 雜質(zhì)B 的細胞毒活性

藥物雜質(zhì)不僅可影響藥物的純度，超過限量的雜質(zhì)可能導致毒副作用。由于呋塞米雜質(zhì)B 的代謝途徑尚未有相關報道，因此本工作假定該化合物通過肝臟代謝，并測試其對于人肝永生化細胞株THLE2 的毒性。檢測雜質(zhì)B 對人肝臟細胞THLE-2 存活率的影響，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B 僅能輕微降低人肝臟細胞THLE-2 的成活率，并具有濃度依賴性（見圖7）。因此，推斷雜質(zhì)B 沒有明顯毒性。

圖7 雜質(zhì)B 對THLE-2 細胞的影響Fig 7 Effect of impurity B on THLE-2 cells

4 總結

綜上所述，本文通過分子疊合及分子場模型，分子對接和藥代動力學性質(zhì)預測等計算化學方法，研究呋塞米雜質(zhì)B 的潛在毒性。雜質(zhì)B 與呋塞米結構相似但柔性更低且水溶性更好，可能與碳酸酐酶2、甲狀腺素結合球蛋白和巨噬細胞抑制因子結合并具有與呋塞米相同的利尿活性。僅從計算模型預測結果來看，雜質(zhì)B 毒性可能較小，易于透過腸道吸收且具有與呋塞米相似的成藥性，有待相關藥理實驗進一步證明。同時，通過體外實驗，驗證雜質(zhì)B 對于THLE-2 細胞沒有明顯影響。對該結果的進一步驗證可以通過對雜質(zhì)B 與碳酸酐酶2、甲狀腺素結合球蛋白以及巨噬細胞抑制因子的表面等離子共振等實驗確定其與上述蛋白的結合能力。進一步的生物學驗證可通過對健康小鼠以雜質(zhì)B 灌胃，測定離體甲狀腺質(zhì)量以及體質(zhì)量的變化驗證其毒性。預測方法的推廣，對于新藥研發(fā)中避免因候選藥物毒性導致失敗具有重要意義。