環狀RNA m6A甲基化修飾的生物功能研究進展

李雨函，曲俊彥，王華，申紅星

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 四川大學華西醫院感染性疾病中心感染科，四川 成都 610041)

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新近發現的無游離3′或5′末端的非編碼RNA，不易被核酸外切酶降解，故比線性RNA更加穩定。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾是RNA甲基中最豐富的修飾之一，由甲基轉移酶、去甲基化酶及閱讀蛋白三種調節因子共同動態調節，其作用機制主要包括RNA輸出[1]、mRNA穩定性[2]、mRNA剪接和免疫耐受[3]等。2017年以前，m6A甲基化修飾的研究只局限于mRNA水平，直到2017年3月，首篇circRNA m6A甲基化修飾發表，填補了此前信息空白[4]。進一步研究表明，circRNA m6A甲基化修飾在疾病的發生發展中具有重要調控作用[5]。因此，本文從如下幾個方面總結circRNA m6A甲基化修飾的生物功能，并對其研究進展作一綜述。

1 circRNA與m6A甲基化

1.1 circRNA

circRNA作為一種獨特的非編碼RNA，在生物體內普遍存在，由pre-mRNA轉錄物反向剪接而成，其5′端和3′端相互連接形成一個封閉的環，沒有5′帽結構和3′多聚腺苷酸尾，致使其不易被核糖核酸酶降解，在細胞中穩定表達，在進化上高度保守[6]。目前，研究表明circRNA功能主要表現在以下幾個方面：① 通過circRNA-miRNA-mRNA軸[7]，影響并調控基因表達[8-11]；② 結合兩種不同的蛋白質，介導其之間的相互作用[12-13]；③ 部分circRNA可作為模板翻譯產生功能性蛋白質[14-15]。研究表明，circRNA在不同疾病中發揮不同的作用(表1)，與心血管疾病[8]、肝細胞癌[9-10]、阿爾茨海默病[11]、乳腺癌[13]和結腸癌[15]等多種疾病的發生發展密切相關。

表1 環狀RNA在不同疾病中的作用

1.2 m6A甲基化

研究表明，已鑒定出160多種RNA分子的修飾方式，但m6A修飾是真核生物中RNA甲基化最豐富的修飾，在維持機體生理狀態及某些病理過程中發揮著重要作用[16]。m6A甲基化修飾與多種疾病相關，如肝癌[17-18]、肥胖[19]、胰腺癌[20]、骨髓性白血病[21-22]等。m6A甲基化修飾是由甲基轉移酶、去甲基化酶及閱讀蛋白三種調節因子共同組成，甲基轉移酶可以催化RNA特定位點形成m6A，去甲基化酶主要發揮m6A 修飾的 RNA 去甲基化的作用，由此使m6A修飾形成一種動態可逆的過程(圖1)。

圖1 m6A甲基化修飾的動態可逆過程

1.2.1 甲基轉移酶 甲基轉移酶主要由甲基轉移酶樣蛋白3(methyltransferase-like protein 3, METTL3)、甲基轉移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14, METTL14)及Wilms腫瘤1-相關蛋白(Wilms tumor 1-associated protein, WTAP)組成。隨著研究的不斷深入，METTL16、RNA結合基序蛋白15/15B(RNA-binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)、病毒樣m6A甲基轉移酶和鋅指CCCH區域結合蛋白13(ZC3H13)等甲基轉移酶的功能也經證實。其中，METTL3起中心作用，與METTL14形成二聚體復合物，WTAP本身雖不具有甲基化活性，但可與上述二聚體復合物相互作用，與細胞核斑點中的各種mRNA前加工因子很好地協同定位于細胞核斑點區，從而影響細胞內m6A甲基化修飾的效率[23-25]；METTL16不僅可作為甲基轉移酶影響RNA的結構，也可作為許多潛在RNA的靶標，如snRNA U6和mRNA MAT2A[26]； 病毒樣m6A甲基轉移酶是m6A沉積所必需的甲基轉移酶，但其分子功能目前尚不清楚；RBM15/15B可以通過直接與mRNA上富含U的序列結合，招募甲基轉移酶復合體，從而影響mRNA翻譯[27]。

1.2.2 去甲基化酶 去甲基化酶包括脂肪肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)、AlkB同源蛋白5(ALKBH5)和AlkB同源蛋白13(ALKBH13)，其中FTO和ALKBH5是人類去甲基化酶種類中最豐富的蛋白，且都定位于細胞核斑點，參與mRNA的剪接過程，表明m6A修飾對mRNA剪接具有一定的影響[28]。上述兩種m6A去甲基化酶的發現更加確切地表明m6A修飾是一種可逆修飾。

1.2.3 閱讀蛋白 閱讀蛋白與特異性結合位點結合，通過識別RNA發揮自身作用[29]，不同的閱讀蛋白在m6A修飾中發揮不同的功能。閱讀蛋白主要由YTH結構域蛋白1-2(YTH domain-containing protein 1-2, YTHDC1-2)和YTH結構域家族1-3(YTH domain-containing family 1-3, YTHDF1-3)組成，識別m6A修飾并產生功能信號。不同的閱讀蛋白發揮不同作用，YTHDC1可促進目的mRNA剪切成小片段，YTHDF2的主要功能是促進mRNA降解；而YTHDF1和YTHDF3則影響mRNA翻譯過程[30]。胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs)作為一種新的m6A識別蛋白，可增強目的mRNA穩定性，促進mRNA核輸出從而調控基因表達[31]。

2 m6A甲基化修飾對circRNA功能的影響

2.1 m6A甲基化相關蛋白修飾circRNA

研究表明，通過RNA免疫沉淀結合高通量測序分析數據，鑒定出1 155個和1 348個circRNA分別與YTHDF1和YTHDF2相互作用，發現無論親本基因mRNA有或者無m6A修飾circRNA，都可觀察到與YTHDF1和YTHDF2相互作用的m6A甲基轉移circRNA，說明circRNA m6A甲基化修飾識別蛋白及甲基轉移酶與mRNA m6A甲基化修飾相同[32]；但二者修飾位點不同，circRNA m6A甲基化修飾位點集中在外顯子上游和中間區域，而mRNA m6A甲基化修飾位點往往集中在最后一個外顯子，位于3′UTR區[33-34]。同時，通過對比HeLa細胞與人胚胎干細胞m6A甲基化修飾的circRNA發現，65% circRNA m6A甲基化修飾基因存在于HeLa細胞中，而人胚胎干細胞中未檢測到，并且在對兩種細胞中都表達的circRNA進行分析發現，兩者m6A甲基化修飾狀態也具有較大差別[35]；由此說明circRNA m6A甲基化修飾具有細胞特異性。

m6A相關蛋白影響具有m6A修飾位點的circRNA豐度和功能，進而影響circRNA在疾病中表達。最新研究表明，上調去甲基化酶FTO表達可提高hsa_circ_0072309在非小細胞型肺癌中的豐度，從而促進非小細胞型肺癌的發生[36]。通過對甲基化相關蛋白的研究，可經m6A甲基化相關蛋白尋找到有差異表達的非編碼RNA。

2.2 m6A甲基化修飾影響circRNA翻譯

有研究指出，內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES)能夠促進circRNA翻譯的啟動，而具有單一或多個位點m6A修飾的circRNA也可通過IRES啟動翻譯，由此表明m6A修飾的存在可能影響circRNA翻譯的進程[37]。經實驗證明，circFBXW7可以在m6A影響下通過驅動IRES翻譯一種21 kD的新蛋白，此進一步證實m6A甲基化修飾可影響circRNA編碼[38]。最近研究表明，circZNF609含有一個開放閱讀框，可將其中一段mRNA序列翻譯成氨基酸，并通過識別YTHD等m6A甲基化修飾蛋白調節翻譯過程[39-40]。學者們進一步將m6A修飾的模序插入至circRNA編碼的起始位點，circRNA翻譯明顯增強；且METTL3和METTL14可促進circRNA翻譯，而FTO抑制circRNA翻譯[41-42]。研究表明，乙肝病毒X蛋白上調METTL3表達，增加circARL3的m6A修飾，促進circARL3反向剪接和翻譯[43]。將YTHDF1，YTHDF2及YTHDF3沉默后，YTHDF1對circRNA翻譯無影響，YTHDF2對circRNA和線性mRNA翻譯都有影響，而YTHDF3只對circRNA翻譯有影響，說明YTHDF3對m6A驅動circRNA翻譯具有重要意義。

2.3 m6A甲基化修飾影響circRNA出核定位

研究人員利用RNA下拉(pull-down)實驗，結合質譜分析及RNA免疫共沉淀實驗，證實circNSUN2與m6A閱讀蛋白YTHDC1相互作用，促進自身以m6A依賴的方式從細胞核向細胞質輸出，促進出核定位；且細胞質中circNSUN2可與IGF2BP2及高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)結合，形成RNA-蛋白質三元復合物circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2，增強HMGA2穩定性[44]。由此表明，m6A甲基化修飾在circRNA的代謝中起著關鍵作用。IGF2BPs作為m6A甲基化修飾蛋白，可與多種mRNA結合，m6A甲基化修飾影響其與靶RNA結合的能力。近期研究揭示，circNDUFB2中m6A的修飾水平增強自身與IGF2BPs的結合強度，進而加強三結構域蛋白25(tripartite motif-containing protein 25，TRIM25)與IGF2BPs結合的活性，三者形成TRIM25/circNDUFB2/IGF2BPs三元復合物促進IGF2BPs的泛素化和降解[45]。上述研究表明，m6A甲基化修飾影響circRNA出核，使circRNA在不同定位情況下執行不同功能。

2.4 m6A甲基化修飾circRNA影響先天性免疫

將純化的外源性circNDUFB2轉染至哺乳動物細胞中，可有效激活先天性免疫基因，誘導先天性免疫，并且起到抗病毒作用；維甲酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid induced gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)作為機體病毒識別和調控體內先天性免疫信號轉導途徑的基因，可檢測到外源性circNDUFB2豐度增加并與其結合，使兩者共同聚集在細胞質中，誘導激活免疫基因[46]。因此，外源性的circNDUFB2可作為強效佐劑誘導抗原特異性T細胞活化、抗體產生及抗腫瘤免疫等作用。circNDUFB2經RIG-Ⅰ識別后激活線粒體抗病毒信號蛋白信號通路，招募免疫細胞，參與IGF2BPs降解和抗腫瘤免疫的激活，而m6A修飾的線性RNA可抑制RIG-Ⅰ活性[45-48]。相關實驗表明，m6A甲基化修飾的人circRNA可抑制先天性免疫，且未被修飾的circRNA可激活RIG-Ⅰ，活化接頭蛋白及線粒體抗病毒信號蛋白下游轉錄因子干擾素調控因子3[49]。

3 結語

CircRNA不僅可以通過直接結合蛋白發揮作用，也可以形成circRNA-miRNA-mRNA分子網絡調控相關通路，并且具有翻譯潛能。m6A甲基化修飾作為真核生物RNA中最普遍的修飾方式，其主要影響mRNA的剪接、出核和翻譯。m6A修飾不僅存在于線性RNA，也與由mRNA剪接的circRNA密切相關，并在疾病的發生發展中起著重要作用。m6A修飾可以影響circRNA出核定位，circRNA也可結合m6A相應的調控蛋白從而影響其穩定性，兩者之間相互調節，互相滲透。