環狀RNA hsa_circ_0079557在胃癌中的表達及其臨床意義

袁海濤， 周曉東， 張垚， 陳正威， 步雪峰

(江蘇大學附屬人民醫院普外科，江蘇 鎮江 212002)

由于胃癌缺乏早期診斷靶點及其發生發展復雜的異質性[1-2]，部分胃癌患者確診時已經失去了最佳手術時期。胃癌發生、擴散和轉移過程除了與幽門螺桿菌感染、肥胖、過量攝入鹽和硝酸鹽以及A型血有關，還與基因突變、表觀遺傳學改變和異常分子信號通路等其他因素相關[3-4]。

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類內源性非編碼RNA，存在于大多數生物體內[5]，主要是通過直接反向剪接或外顯子跳躍生成共價閉合環的機制形成，結構穩定。研究表明，環狀RNA不是剪接錯誤的副產品，環狀RNA表達異?？赡苌婕盎蚺c蛋白調控[6]。環狀RNA還與胃癌發生發展過程有關[7]，其可作為多種腫瘤早期風險評估、臨床治療和生存評估的生物標志物[8]，而高通量測序技術發展和普及更是加快了環狀RNA研究進展。早在2017年Chen等[9]發現，環狀RNA在胃癌組織和血清中表達水平差異可能與腫瘤的發生發展過程以及TNM分期密切相關，但環狀RNA對胃癌細胞增殖遷移等能力影響尚不清楚。因此，本研究利用高通量測序技術檢測5對人胃癌組織中環狀RNA表達譜，進行生物信息學分析得到目的環狀RNA hsa_circ_0079557，檢測其在胃癌患者組織、血清和胃癌、胃黏膜上皮細胞的差異性表達，并利用siRNA沉默hsa_circ_0079557后進行細胞生物功能學實驗。

1 材料與方法

1.1 病例

選擇2017年3月至2019年3月在江蘇大學附屬人民醫院普外科接受根治性手術治療的原發性胃癌患者67例(含測序送檢標本5例)，年齡29～87歲，中位年齡60歲；取胃癌組織與癌旁組織(距離癌組織>5.0 cm)后，加入RNA固定劑于-80 ℃保存備用。所有患者術前均未接受放療或化療。另收集同期20例在江蘇大學附屬人民醫院普外科接受胃癌根治術患者的術前和術后外周血及20例在門診體檢健康者外周血各5 mL，均于清晨空腹抽取肘正中靜脈血，術后采血時間為術后1周。血標本均在取血當日行2 000 r/min室溫離心，取上層血清500 μL，于-80 ℃保存備用。本研究經江蘇大學附屬人民醫院倫理委員會批準，所有檢測樣本在采集前均獲得受試者的知情同意。

1.2 細胞株與主要試劑

人胃癌SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803細胞株均購自南京凱基生物有限公司；人胃黏膜上皮GES-1細胞(美國模式培養物集存庫)。

Trizol、Trizol LS試劑和qRT-PCR相關的逆轉錄及擴增試劑盒均為日本TaKaRa公司產品；胎牛血清、RPMI 1640均為美國Gibco公司產品；脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；siRNA引物設計和合成由廣州銳博生物科技有限公司制作；qRT-PCR相關引物(上海生工生物工程股份有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒、細胞流式試劑盒均為南京福麥斯生物技術有限公司產品；兔抗人一抗細胞周期蛋白依賴性激酶3(CDK3)抗體、二抗HRP羊抗兔抗體均為武漢博士德生物工程有限公司產品。

1.3 高通量測序技術和分析

5對胃癌及癌旁組織經上海歐易生物公司采用第二代測序等技術檢測，預測結果含在circbase數據庫(http://www.circbase.org/)以及檢測到已知或新預測的部分環狀RNA，10個樣本的讀計數均使用DE-Seq軟件進行歸一化處理。計算結果折變，進行差異顯著性分析。選擇在組織中檢測結果為基因序列長度<1 000、差異倍數>2和表達量高的環狀RNA，經對比之后選擇hsa_circ_0079557作為分析與研究的對象。

1.4 細胞培養

胃癌SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803細胞株和胃黏膜上皮GES-1細胞培養在含10%胎牛血清、雙抗的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測hsa_circ_0079557相對表達量

采用Trizol試劑提取胃癌及癌旁組織、胃癌及胃黏膜上皮細胞中總RNA，采用Trizol LS試劑提取胃癌患者術前和術后血清及健康體檢者血清中總RNA，采用Nanodrop2000微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度后，按照逆轉錄試劑盒步驟進行逆轉錄。取cDNA等試劑按照試劑盒說明書配置20 μL反應體系，包括8.2 μL DEPC水、10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ和上、下游引物各0.4 μL 、1 μL cDNA加入8連管中。qRT-PCR條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃5 s，55 ℃退火30 s，40個循環。獨立樣本均設3個復孔，hsa_circ_0079557上游引物為5′-GGTTGCAATGCTGCATTC-3′，下游引物為5′-GCTCCACAATGGATTTGGT-3′，以GAPDH和U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。根據qRT-PCR檢測結果，取hsa_circ_0079557相對表達量的中位數作為分界值，將胃癌組織分為hsa_circ_0079557高、低表達組。并根據其在胃癌細胞株和胃黏膜上皮細胞中qRT-PCR檢測結果選擇相對表達量較高的兩株胃癌細胞(HGC-27、MGC-803)作為后續實驗細胞株。

1.6 細胞轉染

細胞分為siRNA組和si-NC組，分別轉染siRNA和含無義序列siRNA片段的空白對照。每孔加入適量完全培養基，分別在每塊板中接種HGC-27、MGC-803細胞，每孔5×105個，培養12 h左右；取EP管，每管加入100 μL無血清培養基，再加入2 μL Lipofectamine 2000并輕輕混勻配置成a液；取無菌EP管，每管加入100 μL無血清培養基，再加入2 μL siRNA或空白對照，混勻配置成b液；將a、b液混合，室溫放置20 min形成轉染復合物；當細胞密度達30%～50%時，每孔加入200 μL轉染復合物，置于細胞培養箱中培養48 h。qRT-PCR檢測轉染效率，方法同“1.5”。siRNA靶序列為GGAAGTCTGACTCTATCAA、si-NC靶序列為GACTCAGGTACGGAGACCA。

1.7 細胞克隆形成實驗檢測胃癌細胞增殖水平

取“1.6”轉染后細胞，按照每孔5×102個細胞密度接種于6孔板，培養2周。用PBS清洗后，每孔加入1 mL多聚甲醛，4 ℃固定0.5 h；PBS緩緩清洗3次，每孔加入1 mL結晶紫常溫染色15 min，流水清洗至背景干凈，靜置干燥。計數細胞克隆數，克隆形成率(%)=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.8 細胞劃痕實驗檢測胃癌細胞遷移水平

取“1.6”轉染后細胞，每孔1×105個細胞種于6孔板，加入無血清培養基，放置細胞培養箱中培養。細胞單層貼壁達90%時，取無菌10 μL槍頭沿直線每孔劃2條線，PBS清洗3次，洗去脫落的細胞，分別于劃痕后0 h、24 h用顯微鏡觀察拍照。用Image J軟件計算細胞遷移率，細胞遷移率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測胃癌細胞株中CDK3蛋白表達水平

取“1.6”轉染后細胞，PBS沖洗3次，每孔加入1 mL RIPA裂解液，冰上裂解15 min，用刮子沿12孔板孔壁反復刮取，吸入1 mL EP管中，100 ℃煮沸5 min；4 000 r/min離心5 min，取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟測定蛋白濃度，按體積3 ∶1加入配制好的4×上樣緩沖液。

配制10% SDS-PAGE凝膠，80 V電泳30 min，110 V電泳60 min，將總蛋白按分子大小分離；350 mA 110 min，將蛋白轉移到PVDF膜；牛血清白蛋白常溫封閉1 h；加入兔抗人CDK3抗體和兔抗人β-肌動蛋白抗體，均1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次；加入二抗HRP標記的羊抗兔IgG常溫孵育4 h；TBST洗滌3次；加入增強型化學發光顯影試劑曝光，用Image J軟件計算條帶灰度值。

1.10 流式細胞周期分析

收集12孔板中MGC-803細胞培養液，胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，取沉淀細胞；加入1 mL預冷PBS，重懸細胞，1 200 r/min離心細胞，重復2次；取4 mL預冷95%乙醇，渦旋振蕩逐滴加入1 mL細胞懸液，4 ℃固定4 h；1 200 r/min離心5 min，取沉淀細胞；加入預冷的5 mL PBS，重懸細胞并經1 200 r/min離心5 min。每個樣本中加入0.4 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞，37 ℃避光溫浴30 min。用CytoFLEX流式細胞儀在激發波長488 nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。用Flowjo分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 胃癌組織的環狀RNA譜

高通量測序技術檢測5例胃癌組織標本后得到73個環狀RNA，繪制成熱圖(圖1)。選擇其中差異較明顯的hsa_circ_0079557作為后續分析和研究對象。

圖1 胃癌組織中環狀RNA熱圖

2.2 hsa_circ_0079557在胃癌和癌旁組織中表達及其與胃癌患者臨床病理特征的關系

由圖2可見，hsa_circ_0079557在胃癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(t=2.374，P<0.05)。如表1所示，hsa_circ_0079557高表達與腫瘤分期顯著相關(P<0.01)，而與其他臨床病理相關參數無明顯相關性(P均>0.05)。

圖2 hsa_circ_0079557在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達量(n=62)

2.3 hsa_circ_0079557在胃癌患者血清中表達

結果顯示，胃癌患者血清中hsa_circ_0079557表達水平明顯高于健康體檢者(t=4.481，P<0.01)；胃癌患者術前血清中hsa_circ_0079557表達量顯著高于術后(t=3.092，P<0.01)，見圖3。

表1 胃癌組織hsa_circ_0079557表達與臨床病理特征關系

圖3 胃癌患者血清中hsa_circ_0079557相對表達水平(n=20)

2.4 hsa_circ_0079557在胃癌細胞株中表達

結果顯示，hsa_circ_0079557在胃癌SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803細胞株中表達量均明顯高于胃黏膜上皮GES-1細胞(P<0.05或<0.01)，而在不同胃癌細胞株中，HGC-27、MGC-803細胞中hsa_circ_0079557相對表達較高。見圖4。故后續以這兩種細胞株進行轉染與生物功能學實驗。

在HGC-27、MGC-803細胞中，siRNA組中hsa_ circ_ 0079557表達明顯低于si-NC組(t=16.860，5.115，P<0.01或<0.05)，見圖5。

a：P<0.05，b：P<0.01，與GES-1細胞相比

圖5 siRNA敲減后hsa_circ_0079557在胃癌細胞系的相對表達量

2.5 hsa_circ_0079557促進胃癌細胞增殖和部分胃癌細胞遷移能力的改變

如圖6所示，在HGC-27和MGC-803細胞中，siRNA組細胞克隆形成率明顯低于si-NC組(t=3.578，4.021，P均<0.05)。如圖7所示，在MGC-803細胞中，si-NC組遷移率明顯高于siRNA組(t=4.033，P<0.05)，在HGC-27細胞中，si-NC組遷移率高于siRNA組，但差異沒有統計學意義。由此表明，經siRNA敲減hsa_circ_0079557后胃癌細胞增殖下降，部分胃癌細胞遷移能力下降。

圖6 不同胃癌細胞的細胞克隆形成實驗結果比較

圖7 細胞劃痕實驗檢測不同胃癌細胞的遷移率

2.6 hsa_circ_0079557促進胃癌MGC-803細胞周期改變

如圖8所示，在MGC-803細胞中，siRNA組G0-G1期細胞分布明顯高于si-NC組(t=4.153，P<0.05)，siRNA組G2-M期和S期細胞分布明顯低于si-NC組(t=4.028，3.687，P均<0.05)。由此表明，經siRNA敲減hsa_circ_0079557后，處于分裂期的細胞減少，細胞多阻滯于G0-G1期，hsa_circ_0079557促進細胞周期進展。

圖8 流式細胞術檢測敲減hsa_circ_0079557胃癌細胞周期

2.7 胃癌細胞株中CDK3蛋白表達

在胃癌HGC-27、MGC-803細胞中，si-NC組CDK3蛋白相對表達量明顯高于siRNA組(t=3.215，4.376，P均<0.05)。見圖9。

圖9 蛋白免疫印跡檢測敲減hsa_circ_0079557胃癌細胞中CDK3表達

3 討論

以往研究發現，部分環狀RNA與胃癌細胞增殖等功能改變有關[10]，但大部分研究的目的環狀RNA來自circbase等數據庫。本研究利用高通量測序技術檢測胃癌組織和癌旁組織，發現部分差異表達的環狀RNA，得到新的環狀RNA hsa_circ_0079557。利用qRT-PCR技術檢測62對標本發現，hsa_circ_0079557在胃癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，這與測序結果相符；且hsa_circ_0079557高表達與胃癌TNM分期顯著相關；此外，hsa_circ_0079557在胃癌患者血清中的表達高于健康體檢者，在胃癌患者術前血清中表達高于術后。由此表明，hsa_circ_0079557在胃癌組織以及胃癌患者血清中呈高表達，其在胃癌發生發展過程中可能起促癌作用。

Guo等[11]發現環狀RNA廣泛在結直腸中表達，其中hsa_circ_0000069在結直腸癌中表達上調，用siRNA進行敲減，可以降低直腸癌細胞增殖與侵襲能力。Lasda等[12]也發現下調的circPVRL3可促進胃癌MGC-803細胞增殖和遷移。本研究利用siRNA干擾環狀RNA hsa_circ_0079557表達，結果顯示siRNA組胃癌MGC-803和HGC-27細胞增殖能力下降，同時胃癌MGC-803遷移能力下降，但siRNA組HGC-27細胞遷移能力改變不明顯；在流式細胞周期實驗中，siRNA組處于分裂期的MGC-803細胞較空白對照組少，細胞多阻滯于G0-G1期。由此說明，沉默hsa_circ_0079557降低胃癌細胞增殖能力和部分胃癌細胞的遷移能力，可能具有胃癌臨床治療價值；而細胞增殖能力降低可能與細胞周期的改變有關，但為何沉默HGC-27細胞中hsa_circ_0079557表達對其細胞遷移能力改變不明顯尚未可知，有待進一步研究。

近來研究發現，環狀RNA可以通過環狀RNA-miRNA-mRNA之間的相互調節，競爭性結合共同的miRNA反應元件，實現多個RNA與多個靶基因之間的調控網絡，是目前關于環狀RNA等非編碼RNA研究中最重要的作用機制[13-14]。本研究分析預測hsa_circ_0079557可能影響的miRNA靶點及其對應結合的蛋白，其中包含CDK3蛋白。CDK系列蛋白是細胞周期調控機制的核心，CDK系列蛋白原是細胞周期中的限速蛋白，其中，CDK3影響細胞從G0向G1期和G1向S期的轉變[15]。蛋白印跡檢測結果發現，hsa_circ_0079557敲減后胃癌細胞中CDK3蛋白含量下降，其可能是導致胃癌細胞周期改變的關鍵因素。

綜上所述，本研究表明hsa_circ_0079557影響胃癌細胞增殖及細胞周期進展，這可能與hsa_circ_0079557通過調控靶蛋白CDK3有關，且hsa_circ_0079557影響部分胃癌細胞的遷移能力，對胃癌HGC-27細胞的遷移影響不明顯，具體機制有待進一步研究。