藤梨芪瞿方含藥血清對人卵巢癌SKOV-3 細胞形態(tài)及增殖活性的影響

錢月慧， 趙 凱， 雷 蕾

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004； 4.銀川市中醫(yī)醫(yī)院，銀川 750004）

卵巢腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，早期無明顯癥狀，生存期較短[1]。近年臨床觀察發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在治療卵巢癌方面有增效減毒、提高生活質量、延長生存期等優(yōu)勢，目前逐漸成為臨床綜合治療卵巢腫瘤的重要組成部分[2]。卵巢在中醫(yī)中稱“胞宮”“女子胞”，根據(jù)卵巢癌的臨床表現(xiàn)和特征等，屬于“積聚”“癥瘕”“腸覃”的范疇。“癥聚”的最早記載在《素問·骨空論》：“任脈為病，男子內(nèi)結七疝，女子帶下瘕聚。”并提出其病位在奇經(jīng)任脈。《積聚癥瘕雜蟲論第十八》：“積聚、癥瘕、雜蟲者，皆五臟六腑真氣失而邪氣并，遂乃生焉，久之不除也”。《醫(yī)學衷中參西錄》：“女子癥瘕，多因產(chǎn)后惡露未凈凝結于沖任之中，而流走之新血，又日凝滯其上以附益之，逐漸積而為癥瘕”。提出癥瘕發(fā)病機制屬本虛標實，正氣虧虛，沖任虛損，痰瘀互結、瘀血久留，從而發(fā)病。

藤梨芪瞿方在臨床上對卵巢癌的治療取得了很好的效果，但其治病機制目前還不甚明確，故本實驗旨在探討藤梨芪瞿方含藥血清對人卵巢癌SKOV-3 細胞形態(tài)及增殖活性的影響，為今后臨床運用藤梨芪瞿方治療卵巢癌提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SD 大鼠，SPF 級，體質量220～300 g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物許可證號:SCXK（寧）2015-0001，飼養(yǎng)于恒濕、恒溫的籠具中，自由攝入標準大鼠飼料和無菌水。適應1 周后進行試驗。

1.2 試劑和儀器

實驗室所用細胞為人卵巢癌SKOV-3 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：C-0215）；CLARK 胎牛血清（FBS，上海慧穎生物科技有限公司，批號：FB25015）；McCoy′s 5A 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WHO1111806XP）；0.25%胰蛋白酶溶解液（北京索萊寶科技有限公司，批號：T1320）；PBS（HyClone，批號：AD20616267）；DMSO（Biotopped）；HE 染色液（森貝伽生物科技有限公司）；MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）Antibody（Affinity，批號：AF6311）；Cytochrome c Antibody（Affinity 公司，批號：AF0146）。CO2培養(yǎng)箱（德國nuaire 公司）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；CKX31倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；TDZ5-WS 臺式低速離心機（長沙湘儀儀器有限公司）；TS-8 型轉移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；全波長酶標儀（Molecular Devices 公司）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司）；蛋白濃度定量儀（Eppendorf 公司）；電泳儀（北京六一公司）。

1.3 藥物制備和分組

藤梨芪瞿方按傳統(tǒng)方法煎煮，并將藥液濃縮，制備成1 mL 含3.25 g 生藥的湯劑，注射用順鉑（凍干型）用生理鹽水配制，制備濃度為1 mg·mL-1。將48 只雄性大鼠，隨機分為4 組，每組12 只，分別為生理鹽水組（生理鹽水灌胃）、順鉑組（腹腔注射順鉑）、藤梨芪瞿方組（藤梨芪瞿方灌胃）、藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組（藤梨芪瞿方灌胃、腹腔注射順鉑）。給大鼠連續(xù)灌胃5 d（參考文獻[3]確定給藥劑量：給藥劑量=臨床常用劑量×動物等效劑量系數(shù)），生理鹽水組按1 mL/100 g 給藥，藤梨芪瞿方組及聯(lián)合組給予藤梨芪瞿方水煎劑濃縮液，按0.8 mL/100 g 給藥，2 次/d，順鉑組及藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組于第1、3、5 天腹腔注射，每0.5 mL/100 g，于第4 天晚禁食不禁水，第5 天末次給藥1 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心臟取血，靜置1 h 后，3 000 r·min-1，10 min，吸取上清，將同組大鼠的血清混合，消除個體差異，置于56 ℃水浴鍋中，滅活30 min，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含藥血清的配制

以5%為例，配制10 mL 含藥血清，在培養(yǎng)瓶中加入0.5 mL 含藥血清，9.5 mL 的McCoy＇s 5A培養(yǎng)液，依據(jù)此法，依次配制10%、20%含藥血清。

1.5 SKOV-3 細胞培養(yǎng)

將凍存的細胞放入37 ℃水浴鍋中快速解凍，離心后，棄上清，加入提前配制好的完全培養(yǎng)液（McCoy＇s 5A 培養(yǎng)基中加入10%的FBS、1%的青霉素和鏈霉素）1 mL，輕輕吹打混勻，將混勻的細胞液移入提前加入4 mL 完全培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中，左右晃動，混勻后放入CO2培養(yǎng)箱中，隔天更新培養(yǎng)液，待細胞長滿70%～80%后用于實驗。

1.6 MTT 法檢測SKOV-3 細胞增殖活性

取對數(shù)生長期的SKOV-3 細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)，調整濃度為6×104/mL 接種于96 孔板培養(yǎng)，將細胞分為對照組及實驗組，實驗組對應含藥血清各分組，培養(yǎng)24 h 后，吸棄原培養(yǎng)液，各實驗組分別加入相應5%、10%、20%濃度的含藥血清培養(yǎng)液100 μL。對照組不加含藥血清，每組設3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。藥物分別干預24、48 h 后每孔加入10 μL MTT，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后取出，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩器低速振蕩10 min，在酶標儀490 nm波長處測定各孔光密度值（OD 值），并計算細胞生長抑制率，抑制率（IR）=（對照組OD 值－實驗組OD 值）/對照組OD 值×100%。

1.7 HE 染色觀察SKOV-3 細胞形態(tài)

培養(yǎng)細胞，取對數(shù)生長期人卵巢癌SKOV-3細胞，消化離心，制成單細胞懸液，計數(shù)，然后調節(jié)細胞濃度為1×105/mL，準備6 孔板，在6 孔板中事先放入無菌蓋玻片，加入細胞懸液，制成細胞爬片，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待貼壁；24 h顯微鏡下觀察細胞貼壁后，棄上清，分別加入新鮮完全培養(yǎng)基及提前配制好的20%含藥血清，48 h 后取出蓋玻片；用1×PBS（pH7.4）沖洗蓋玻片，沖洗3 次，3 min/次，然后用4%的多聚甲醛固定25 min，取出自然晾干，保存于-20 ℃的冰箱中；從-20 ℃冰箱中取出固定好的不同實驗組的細胞片，用1×PBS 沖洗3 次，3 min/次；將沖洗完成的細胞片放于去離子水中，浸泡5 min；蘇木精染色：將細胞片放入蘇木精染液中，使染液全部覆蓋細胞片，染色5 min，然后用水沖洗3 次去掉多余染料；用1%鹽酸乙醇水洗3 次，3 s/次；用1%的氨水返藍水洗3 次，10 s/次；伊紅染色：在每張細胞片上滴加0.5%伊紅染液，染色3 min，水洗3 次；脫水、透明：依次放入70%、80%、90%、95%乙醇中2 s，然后放入無水乙醇中2 次，3 min/次，逐級脫水；透明：脫水后的細胞片放入乙醇及二甲苯的混合液中3 min，最后放入二甲苯中2 次，5 min/次；封片：中性樹膠封片。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

1.8 Western blot 檢測細胞色素C（Cyt C）、Caspase-3 蛋白表達

1.8.1 蛋白濃度的測定 取對數(shù)生長期細胞，消化離心后，加入完全培養(yǎng)液制成單細胞懸液；將制成的單細胞懸液接種于6 孔板中，并標記對照組、生理鹽水組、順鉑組、藤梨芪瞿方組、藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組，置于細胞培養(yǎng)箱24 h；24 h后，取出6 孔板，棄上清，按照分組加入20%含藥血清干預48 h；干預48 h 后，移棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次。加入RIPA裂解液，迅速用細胞刮刀將細胞刮下放入1.5 mLEP 管中，冰上裂解30 min，并且輕輕吹打，使細胞充分裂解；4 ℃下，12 000 r·min-1離心10 min，將上清移入新的1.5 mL EP 管中，每管中取少量上清進行BCA 蛋白濃度測定。SDSPAGE 凝膠電泳與轉膜。

1.8.2 免疫印跡 1）封閉：準備5%脫脂奶粉的封閉液，將轉移膜置于其中，室溫在搖床上封閉2 h。2）一抗反應：一抗工作液中，放入封閉后的膜，一抗需要用PBS 稀釋（Caspase-3 一抗稀釋比為1∶1 000，Cyt C 的一抗稀釋比為1∶1 500）；4 ℃反應過夜；洗膜：室溫下，用1×PBST 快速搖動洗滌反應膜3 次，10 min/次。3）二抗反應：用1×PBST稀釋二抗（1∶3 000）；二抗工作液中，放入洗滌后的一抗反應膜，室溫搖床90 min 后，洗去膜上殘留二抗，洗膜3 次，10 min/次。4）曝光及洗片：將PVDF 膜放至有保鮮膜的暗盒中，避光，滴加混合好的ECL 試劑盒中A、B 液（1∶1）。再折疊保鮮膜，包裹住PVDF 膜，進行曝光；將膠片掃描后，用Tanon Gis 軟件測定條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）進行描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藤梨芪瞿方含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細胞增殖活性的影響

MTT 法檢測結果顯示：同等細胞處理條件下，與生理鹽水組相比，順鉑組、藤梨芪瞿方組、藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組細胞增殖活性均下降（P 均＜0.01）；與順鉑組、藤梨芪瞿方組相比，藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組細胞增殖活性均下降（P均＜0.05）；相同時間干預下，隨著含藥血清濃度的增加含藥血清處理組細胞增殖活性逐漸下降（P 均＜0.05）；相同藥物濃度干預下，隨著干預時間的增加，細胞增殖活性下降（P＜0.05）。20%濃度含藥血清干預48 h，藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組抑制細胞增殖能力最強，見表1。

表1 藤梨芪瞿方含藥血清對人卵巢癌SKOV-3 細胞增殖活性的影響（±s，%）

表1 藤梨芪瞿方含藥血清對人卵巢癌SKOV-3 細胞增殖活性的影響（±s，%）

與生理鹽水組相比#P＜0.01；與藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組相比*P＜0.05，**P＜0.05。

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2.2 藤梨芪瞿方含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細胞形態(tài)的影響

對照組及生理鹽水組細胞形體飽滿，呈多邊形，邊緣清楚。含藥血清干預48 h 后，在光鏡下觀察SKOV-3 細胞，數(shù)量減少，細胞形體發(fā)生變化，細胞邊緣不清，核仁清晰，出現(xiàn)核固縮，染色質緊貼于細胞核。藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組較順鉑組、藤梨芪瞿方組細胞形體變化更為明顯，見圖1。

圖1 鏡下人卵巢癌SKOV-3 細胞形態(tài)（HE×200）

2.3 藤梨芪瞿方對人卵巢癌SKOV-3 細胞Cyt C、Caspase-3 蛋白表達的影響

順鉑、藤梨芪瞿方、藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑含藥血清處理的SKOV-3 細胞后其Cyt C、Caspase-3蛋白表達水平均上升。與生理鹽水組相比，順鉑組、藤梨芪瞿方組、藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組Cyt C、Caspase-3 蛋白表達均上升（P 均＜0.01）；與順鉑組、藤梨芪瞿方組相比，藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組Cyt C、Caspase-3 蛋白表達水平均上升（P 均＜0.05）；與順鉑組相比，藤梨芪瞿方組Cyt C、Caspase-3 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖2、表2。

圖2 各組SKOV-3 細胞內(nèi)Cyt C、Caspase-3 蛋白的表達情況

表2 各組SKOV-3 細胞內(nèi)Cyt C、Caspase-3 蛋白的表達情況（±s）

表2 各組SKOV-3 細胞內(nèi)Cyt C、Caspase-3 蛋白的表達情況（±s）

與生理鹽水組相比#P＜0.01；與藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組相比*P＜0.05，**P＜0.05。

組別nCyt CCaspase-3對照組0.369±0.011 0.512±0.016生理鹽水組12 0.384±0.023 0.461±0.010順鉑組12 0.812±0.057** 0.985±0.110**藤梨芪瞿方組12 0.676±0.123* 0.872±0.070*藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組 12 1.050±0.032# 1.171±0.035#P 值＜0.05＜0.05

3 討論

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)中藥在抗腫瘤方面具有多靶點、特異性強及可逆轉耐藥等優(yōu)勢，臨床治療腫瘤效果明顯[4]。藤梨芪瞿方是趙凱教授自擬治療卵巢癌經(jīng)驗方，具有“扶正祛邪、補益沖任”的功效，臨床對于幫助術后恢復、減輕化療毒副反應、抗腫瘤、提高存活率等方面有積極作用。對于女性來說，經(jīng)歷經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)后，沖任氣血不足，因虛致瘀、留痰，痰瘀等病理產(chǎn)物留于任脈，導致沖任日益虛損，癌不斷發(fā)展。藤梨芪瞿方由藤梨根、黃芪、瞿麥、太子參、茯苓、薏苡仁、石見穿、桂枝、露蜂房、制附子、川牛膝、柴胡、鱉甲、甘草組成，旨在補益沖任，解毒祛濕，方中藤梨根、黃芪、瞿麥共為君藥，藤梨根可清熱解毒，清熱利濕、解毒消腫，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，藤梨根抗腫瘤作用明顯，可通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡等途徑發(fā)揮作用，并且可在放化療后，減輕藥物產(chǎn)生的不良反應[5-6]；黃芪可補氣升陽、益衛(wèi)固表，黃芪中的主要活性成分黃芪甲苷可調節(jié)腫瘤微環(huán)境、增強化療藥物敏感性、調控信號通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖[7]；瞿麥可利尿通淋、破血通經(jīng)，瞿麥可正丁醇部位的有效成分可抑制腫瘤細胞的增殖活性[8]；太子參、茯苓、薏苡仁健脾祛濕，石見穿、露蜂房解毒消腫共為臣藥；桂枝、制附子溫里散寒，川牛膝活血化瘀、柴胡疏肝理氣、鱉甲軟堅散結為佐藥，甘草調和諸藥為使藥。

目前，大部分治療腫瘤的藥物都是通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用的。誘導腫瘤細胞凋亡也是治療腫瘤的一種有效途徑。在生物體內(nèi)的凋亡途徑中，線粒體凋亡途徑被認為是經(jīng)典的凋亡途徑之一。Cyt C 從線粒體間隙釋放到細胞質中是線粒體凋亡的開始[9]，當Cyt C 被釋放進入細胞質后，在dATP 的參與下，與凋亡蛋白酶活化因子結合形成凋亡復合體[10]，激活Caspase 家族中的凋亡執(zhí)行者Caspase-3，Caspase-3 可直接破壞細胞結構，形成凋亡小體，從而引發(fā)細胞凋亡[11]。

實驗結果顯示，經(jīng)順鉑、藤梨芪瞿方含藥血清處理的SKOV-3 細胞體積縮小，細胞核固縮，染色質顏色加深，細胞質和細胞核區(qū)別不明顯；且藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組較單一藥物處理組細胞變化更明顯。同時，順鉑、藤梨芪瞿方含藥血清處理的SKOV-3 細胞24、48 h 后，5%、10%、20%濃度的順鉑、藤梨芪瞿方含藥血清均能抑制SKOV-3 細胞的增殖，且隨著濃度的增加，對細胞增殖的抑制能力越強，而且藤梨芪瞿方含藥血清聯(lián)合順鉑比單一處理抑制細胞增殖的作用更強。WB 實驗結果提示，與生理鹽水組相比，藤梨芪瞿方及藤梨芪瞿方聯(lián)合順鉑組SKOV-3 細胞內(nèi)Cyt C、Caspase-3 蛋白表達水平明顯上升。這些結果都表示，藤梨芪瞿方可協(xié)同順鉑抑制人卵巢癌SKOV-3 細胞增值活性，誘導SKOV-3 細胞凋亡，其可能的機制是通過激活線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。