長鏈非編碼RNA 與心血管疾病關系研究進展

閆 麗， 葛智儒

（1.寧夏醫科大學，銀川 750004； 2.上海市浦東新區公利醫院心血管內科，上海 200135）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在轉錄和轉錄后調節以及染色質修飾中發揮著關鍵作用。許多研究發現lncRNA 與心肌損傷及心血管疾病有關聯，表明lncRNA 對心血管疾病的發生、發展具有重要意義。本文綜述了循環lncRNA 生物學特性以及lncRNA 與動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭、心臟肥大、高血壓、心律失常等心血管疾病關系的研究進展。

1 lncRNA 的發現、分類和作用機制

基因組研究發現，只有不到2%的哺乳動物基因被翻譯成蛋白質，其他大部分是無編碼功能的非編碼RNA（ncRNA）。先前ncRNA 被視為遺傳轉錄中的一種“垃圾”，是不具有功能的[1-2]，隨著研究的深入，發現tRNA 和rRNA 參與了基因的表達，小核RNA（snRNA）作為結構非編碼RNA共同存在。近年來，微小RNA（miRNA）、環狀RNA（circRNA）、小干擾RNA（siRNA）以及lncRNA 逐漸進入人們的視線，并發現它們在細胞中具有重要的調節作用[3]。其中lncRNA 具有比蛋白質基因組更強的調控能力和組織特異性，是ncRNA 的最主要組成部分[4]。

lncRNA 為轉錄本大于200 個核苷酸的非編碼RNA，和信使RNA（mRNAs）一樣，它們通常經RNA 聚合酶Ⅱ轉錄，進一步剪接和聚腺苷酸化，但它們沒有或具有很低的編碼能力。依據lncRNA在基因序列相較mRNA 的所在位置，目前被分為以下六類：（1）基因間，lncRNA 是位于兩個氨基酸編碼基因序列基因組間隔內的轉錄本；（2）內含子lncRNA，是從氨基酸編碼基因序列的內含子轉錄而來；（3）雙向lncRNA，是位于緊鄰蛋白編碼基因的相反鏈中，靠近啟動子區域1 kb的基因組內；（4）增強子lncRNA，通常位于小于2 kb 增強子區域內；（5）正義lncRNA，位于編碼基因的同一鏈上，重合一個或多個內含子和外顯子；（6）反義lncRNA，位于編碼序列基因的反向鏈上，重合一個或者多個內含子和外顯子[5]。雖然一些lncRNA 被證明進化是保守的，但與蛋白質編碼轉錄本相比，大量lncRNA 并不表現出相同水平的保守約束[6]。許多lncRNA 位于合成基因組區域，以細胞類型特定的方式顯示物種之間的保守表達模式，因為它們的調節元件和啟動元件相似[7-8]。lncRNA 具備種群特異性，且細胞之間的特異性強，由于lncRNA 有著相對較長的堿基序列，可以完成多種RNA-RNA 交互作用和構成繁雜的三維空間形態，其獨特的物理構型使lncRNA 可以與靶基因建立核結構域并結合蛋白質形成RNA-DNA-蛋白質復合物[9]；開放的單鏈RNA 序列使得lncRNA 可以通過與其他堿基序列相結合發揮其基本功能[10]。因此，lncRNA 可以通過多元化的機制來減弱或觸發基因的轉錄調控。

lncRNA 通過與蛋白質的相互作用形成蛋白質復合物，根據它們的細胞定位可以作為染色質修飾劑，修飾染色質的特定位點[11]；作為信號分子，調節細胞過程，從染色質中分離蛋白質的分子裝飾[12]。核內lncRNA 還參與調控染色質，通過直接與基因組DNA 相互作用，將表觀遺傳修飾因子招募到特定位點[13]，還有一些lncRNA 結合相鄰基因組位點啟動基因組印跡[14]。經直接RNA交互作用，lncRNA 通過調節蛋白質的穩定性[15]、翻譯[16]和剪接[17]來調節蛋白質的轉錄。通過間接調節轉錄水平的方法，lncRNA 還被證明能將miRNAs 從內源性靶點中分離出來，并充當分子海綿[18]。lncRNA 還可以轉錄后調節其靶基因，間接地充當miRNA 的前體，既可調控其靶基因lncRNAs，也可以編碼短肽[19]。綜上，lncRNA 主要存在于細胞核中，可以與多種核內的蛋白發揮協同作用，在表觀遺傳方向調節基因序列的表達。存在于胞質中的lncRNA 能調節蛋白質導向、mRNA 穩定性和翻譯。雖然具有活性細胞表達的lncRNA 的列表正在穩步增長，但人們對功能性lncRNA 的理解仍然非常有限。

2 心臟特異性lncRNA 的生物學功能

利用大規模的轉錄組測序技術（RNA-Seq），在心臟發育過程以及成年后健康心臟和心肌梗死、壓力超負荷等模型，對心血管系統內多種類型的細胞進行基因表達譜分析，已經找到數千種心臟特異性lncRNA，并且發現心臟特異性lncRNA 在胚胎期與成年心臟的相對表達差異較大，而在成年心臟與疾病模型之間差異很小，表明心臟特異性lncRNA 在心臟發育中具有關鍵作用。心臟發育涉及多類細胞同時分化的生物過程，基因序列表達的精密時間和空間調節參與其中[20-21]。在心臟發育過程中起關鍵作用的lncRNA包括Bvht（Braveheart）、Fendrr（Fetal-lethal noncoding development regulatory RNA） 和Kcnqlot1等[22-24]。了解心血管lncRNA 在發育和疾病過程中的生理作用，并弄清它們的調控功能是順式還是反式機制運行，通常需要對lncRNA 表達進行實驗性調節。

2.1 Kcnqlot1 與心臟發育

Kcnq1 是一個編碼K+通道的基因，它最初是印跡基因，但在心臟發育過程中成為雙鏈等位基因，而lncRNA Kcnqlot1 是Kcnq1 基因的內含子11 向反義方向轉錄形成的。2012 年9 月，Korostowski 等[22]提出，特別是在心臟中，Kcnqlot1 也可轉換為雙等位基因表達，并且與Kcnq1 表達具有相同的時間窗；進一步研究表明，在心臟發育早期，Kcnq1 印跡基因水平不依賴Kcnqlot1 的轉錄，而在心臟發育的后期，存在明顯的相關性。并且Kcnqlot1 具有調節Kcnq1 的表達作用，在胚胎期16.5 d，K-小鼠的Kcnq1 水平明顯高于野生型小鼠。此外，他們還發現Kcnq1 水平的增加伴隨著一個異常的三維染色質結構。他們的研究顯示，Kcnqlot1 經過修飾染色質可變性和調控增強子，從而調節Kcnq1 的相對表達量。

2.2 Bvht 與心臟發育

麻省理工學院的Klattenhoff 等[12]發現，在小鼠的18 號染色體上具有小鼠特異性lncRNAAK143260，簡稱Bvht，對心臟發育至關重要。Bvht開始在小鼠的胚胎干細胞發育階段的早期表達，成年的心臟中相對表達量也很高。他們發現，小鼠胚胎干細胞中Bvht 的耗竭會導致跳動的心肌細胞丟失，并導致心臟轉錄因子系統激活失敗，其中包括Nkx2.5 和Mesp1（心血管祖細胞的一個標記物，它決定了心臟所有細胞的最終類型）。通過轉錄組學分析，認為Bvht 在心源性Mesp1 的上游起作用，以誘導其表達并指導心臟基因調控系統的正確激活。他們還觀察到Bvht和SUZ12（多梳抑制復合物的組成部分）互相作用，進而促進組蛋白H3 賴氨酸27 甲基化，并且參與調控心臟的表觀遺傳。此外，Bvht 耗竭的新生兒心肌細胞表現出異常的肌原纖維，a-肌球蛋白和b-肌球蛋白重鏈表達降低[12]。

2.3 Fendrr 與心臟發育

在Bvht 發現不久，Grote 等[23]報道了另一種中胚層中富集的長2 397 bp 的lncRNA-Fendrr，對于小鼠心臟和體表的發育極其重要。Fendrr 是從基因Foxf1 分化轉錄而來，該基因在外側板中胚層特異性表達，產生心臟和體壁肌。他們發現，小鼠Fendrr 的缺失導致心臟和體壁的發育受損，引起心肌功能障礙，最終使得E13.75 左右胚胎致死率升高。還發現小鼠體內Fendrr 的缺失，增加了胚胎初期E8.5 的Nkx2.5 和Gata6（心臟發育的轉錄序列）的相對含量。與Bvht 類似，Fendrr表觀遺傳調控心臟發育的一些轉錄因子，包括GATA-6、NKX2-5、FOXF1、TBX3、IRX3 和PITX2。然而，Fendrr 的丟失增加了Nkx2.5 和Gata6 啟動子上H3K4me3 的甲基化狀態，而使得靶基因表達降低。他們的研究結果表明，Fendrr 與Bvht 類似，通過表觀遺傳調控心臟轉錄因子的表達，對心臟發育起到至關重要的作用。

3 循環lncRNA 與心血管疾病

循環lncRNA 作為心臟生物標記物的研究進展較緩慢，lncRNA 在體液中不穩定，大多數lncRNA在神經母細胞瘤細胞系中是穩定的，所以lncRNA為心血管疾病的發生和轉歸中的表觀遺傳學研究提供了極為有益的方法。

3.1 lncRNA 與動脈粥樣硬化

炎癥是生命體抵抗外傷和受到感染時的一種自身的防御反應。動脈粥樣硬化病變是很多心腦血管疾病的基礎，是一個繁雜的慢性炎癥過程[24]。近期有幾項研究顯示，lncRNA 在動脈粥樣硬化發生過程中起關鍵作用。

3.1.1 Ang362 已知血管平滑肌細胞（VSMC）的增長在動脈粥樣硬化的發展中具有不可或缺的作用。最近的研究[25]顯示，lncRNA 與miRNA 之間的正向調控和VSMCs 的增殖及肥大有關，從而促進動脈粥樣硬化。并發現lncRNA-Ang362 與miR-221/222 相近，且和VSMCs 中的miR-221/222 共同轉錄。通過AngⅡ治療，循環中Ang362和miR-221/222 以時間依賴的方式增加。Ang362的下調降低了miR-221/222 和McM7（與DNA 復制的開始和細胞周期有關）的表達，并且還阻礙VSMCs 的增生。雖然目前仍然不清楚McM7 究竟是不是miR-211/222 的可能靶標，但lncRNAAng362 通過正調控McM7 和miR-221/222.3，從而使得AngⅡ引起的血管功能障礙加劇，進而促進動脈粥樣硬化的形成[25]。

3.1.2 ANRIL（anti-sense noncoding RNA in the INK4 locus） 2013 年2 月日本大阪大學的Congrains 等[26]研究稱，用小干擾RNA 敲低主動脈VSMC 中的ANRIL（由染色體9p21 位點編碼的lncRNA）會降低細胞增殖，并且小干擾RNA 特異敲除相異的ANRIL 外顯子1 和19，致使機體動脈粥樣硬化有關通路基因表達的發生明顯改變。2013 年7 月Holdt 等[27]報道，ANRIL 的過表達可增加細胞黏附，促進細胞增殖和減少細胞凋亡，這些都是動脈粥樣硬化發展的重要機制，進一步研究發現，ANRIL 特異基因序列的啟動子結構區富含Alu 基因序列，這對于轉錄調控和促動脈粥樣硬化機制至關重要。這些研究證明ANRIL 與動脈粥樣硬化發展及嚴重程度顯著相關。

3.1.3 RP5-833A20.1 lncRNA RP5-833A20.1存在于核因子IA（NFIA）基因序列的內含子2中，轉錄方向與NFIA 相反。lncRNA RP5-833A20.1負向調節NFIA 的mRNA 和蛋白含量，而NFIA是miR-382-5p 的靶點，NFIA 蛋白表達含量降低的是由RP5-833A20.1 的過表達引起的，加重了THP-1 巨噬細胞的炎性反應和脂質積累，而hsamiR-382-5p 抑制劑完全可以延緩脂質沉積和炎性反應[28]。然而，miR-382-5p 和RP5-833A20.1之間存在的基因相關性仍然很少被探索，仍需更進一步破解。

3.2 lncRNA 與心肌梗死（MI）

MI 是多見的致命性心血管疾病，雖然近年來取得了一些進展，但MI 的分子機制實質上依舊沒有完全闡明。目前已經證實，miRNA 參與MI的發生和發展，并基于miRNA 的治療方法可能會發揮作用[29]，但lncRNA 在MI 發生中的主要作用研究很少。一些單核苷酸多肽（SNP）分析表明lncRNA 與MI 之間具有關聯性。

3.2.1 MIAT（MI-associated transcript） 2006 年10 月，日本的Ishii 等[30]在MIAT 中發現了6 個SNP。他們首先明確了急性心肌梗死易感位點位于染色體22q12.1 染色體上，并在該位點上發現了新基因，即MIAT。緊接著，他們發現MIAT 由5個外顯子組成，進一步實驗證明其未編碼任何產物。此外，體外功能分析顯示外顯子A11741G 中有一個SNP 比正常的等位基因增加了MIAT 的轉錄水平，而其他5 個SNP 沒有顯示出轉錄差異。他們分析認為，SNP 改變了MIAT 的表達或許與MI 的病發機制相關。

3.2.2 KCNQ1OT1 2014 年9 月，Vausort M 等[31]發現，MI 患者的外周血與身心健康志愿者的外周血相比較，lncRNA 缺氧誘導因子1A 反義RNA 2，成員1 相反鏈/反義轉錄本1（KCNQ1OT1）和與轉移相關的肺腺癌轉錄本1 的水平較高。與非ST 段抬高MI 患者相比，ST 段抬高MI 患者的ANRIL，KCNQ1OT1，MIAT 和轉移相關的肺腺癌轉錄本1 水平較低。

3.3 lncRNA 與心力衰竭（HF）

HF 是各種心臟結構或者功能性疾病致使心室充盈或射血能力損壞的一種綜合征，是許多心血管疾病的危重和終末階段，多并發于心肌梗死、心肌病和心肌炎等。雖然在診療水平上不斷提高，但HF 迄今依然是一個嚴重的衛生保健難題。雖然在蛋白質介導的轉錄調節和信號通路取得顯著進步，但仍然未能實現對該疾病關鍵診療的突破。近年來，大量lncRNA 的檢測結果以及ncRNA 參與基因表達中多種調控作用可能會提供一些線索[32]。

3.3.1 NRF（Necrosis-related factor） Wang 等[33]在建立小鼠缺血再灌注模型中發現一種lncRNA，即NRF，它是一種與細胞質中的miR-873 互相作用的內源性lncRNA。研究[32]發現，NRF 的敲除可以增加miR-873 的表達，降低miR-873 的下游目標RIPK3 和RIPK1 的表達水平（PIPK1 和RIPK3 參與H2O2誘導的小鼠心肌細胞壞死），使得心肌壞死急劇減少。他們發現，NRF 能夠在轉錄水平實行調控，在NRF 的啟動子區檢測到p53的結合部位。H2O2增加了NRF 啟動子同p53 的關聯，芯片檢測進一步表明p53 增加了NRF的活性，從而影響下游因子。功能測定表明，敲除p53可減少細胞壞死，抑制NRF 啟動子在H2O2上的活性。miR-873 的表達增加，RIPK1/RIPK3 的水平降低，也是由下調的P53 水平引起的。這些結果闡明了心肌細胞壞死過程中lnc RNA-miRNAmRNA 軸的調控關系，為探討心肌功能障礙的潛在治療靶點提供依據。

3.3.2 LIPCAR LIPCAR 是線粒體來源的長鏈非編碼RNA，LIPCAR 有可能參與介導線粒體通路，如氧化磷酸化。線粒體功能紊亂導致多種心血管疾病的發生，特別是冠狀動脈粥樣硬化型心臟病和心力衰竭的發生。2014 年Kumarswamy研究團隊發現[34]，血漿中LIPCAR 與心肌梗死后左心室重構程度呈顯著正相關。隨后，該研究團隊還發現，血漿中LIPCAR 水平在慢性心衰和心梗后1 年慢性心力衰竭患者血漿中表達量增加，可以預示心衰患者的存活率。初步發現LIPCAR與左心室舒張功能的下降和心室重塑的發生有關，但LIPCAR 廣泛臨床的運用意義以及作用功能仍需全面的探究。

3.4 lncRNA 與心律失常

心律失常，尤其是惡性心律失常，與心血管疾病的患病率和病死率有關。遺傳因素與心律失常的發生和進展有關，其中包括神經代謝、Ca2+調控的功能障礙以及心臟結構和電通路重塑[35]。因此，將要被發現的標志性的心律失常診療和轉歸的靶向標記物對控制這種情況和防治心臟猝死具有重大的意義。

研究[36]發現，lncRNA 可以通過調節不同的mRNAs 來影響心房顫動（atrial fibrination AF）的進展，lncRNA-AK055347 經過調控MSS51、Cyp450和ATP 合成酶，從而促進AF 的發病。上調miR-208b 可抑制心房重構過程中SERCA2、CACNB2和CACNA1C 的表達和功能。lncRNA 經過miRNA及其特定的mRNA 相互作用，致使AF 發展中的電重塑。于TCON_00075467 基因的敲除組5 只兔中，有3 只兔誘導房顫，而且沉默TCON_00075467可明顯減短原發性心房肌細胞的L 型鈣電流（ICaL）、有效不應期（AERP）和動作電位（APD），揭示了抑制TCON_00075467 含量與房顫的產生存在關系[35]。

3.5 lncRNA 與心臟肥大

持續的心臟肥大常伴有適應不良的心臟重塑，導致順應性下降并使得心衰風險增加。適應不良的心臟肥大被看作與HF 患者的發展有關。2014 年2 月，中國動物學研究所的Wang 等[37]研究表明，lncRNA CHRF（心臟肥大相關因子）參與AngⅡ靶向基因miR-489 誘導心臟肥大的病理過程，CHRF 通過充當miR-489 的內源性海綿來降低miR-489 的水平。

3.6 lncRNA 與擴張型心肌病

擴張型心肌病是以心室的擴大及收縮功能受損為特點的心臟疾病，常致充血性心力衰竭的發生。遺傳在擴張型心肌病的病變中具有重要作用。2009 年Friedrichs 等[38]確定了一個基因組區域（5q31.2～3），該區域具有白種人發生擴張型心肌病的風險等位基因，類固醇受體RNA 激活物（SRA）基因同時產生類固醇受體RNA 激活蛋白和幾個非編碼SRA 轉錄本。將該區域的SRA1敲除可以引起斑馬魚心室收縮功能障礙，揭示SRA1 與擴張型心肌病的關系。

3.7 lncRNA 與高血壓

高血壓是最多見的心血管疾病之一，然而高血壓發生、發展的分子機制仍然未能全部闡釋。氧自由基被指出與血管內皮功能和妊娠期高血壓相關[39]。近期一些研究[40]表明，lncRNA 在高血壓發生發展中起到一定的作用，發現MALAT1 可以調控血管生長和內皮細胞功能，SENCR 被認為是一類新型血管細胞富集的lncRNA，與平滑肌細胞表型有關[41]。另外的研究[42]發現，在Dahl 鹽敏感型的大鼠與原發性高血壓大鼠間發現了749 個相異表達的lncRNA。然而，lncRNA 對高血壓影響的研究只是起步階段。

3.8 lncRNA 與動脈瘤

動脈瘤的特點是血管壁變薄和血管病理性增寬，常發生在大動脈，破裂后可導致死亡。microRNA 參與動脈瘤形成[43]，但lncRNA 與動脈瘤的關系研究處于初步階段。有報道[44-45]顯示，全基因相關研究確定ANRIL 存在與腹主動脈瘤有關的遺傳易感染性的基因位點。Foroud 等[46]通過基因組關聯研究證實了ANRIL 可以作為顱內動脈瘤風險因子。然而，ANRIL 在動脈瘤中的作用功能仍然不明確，需要通過更多功能實驗加以驗證。

4 總結和展望

lncRNA 的基本功能是近些年來生命科學及醫學科學研究關注的領域，發展非常迅速。識別特異的lncRNA，針對疾病的診斷治療極其重要。迄今已經發現多種lncRNA 與心力衰竭、冠心病、心肌梗死及心律失常等心血管疾病的生理以及病理生理過程相關。盡管目前的研究僅闡明了少數lncRNA 的作用機制，而lncRNA 卻能以多種方式參與心血管疾病的發生發展。可以預測，通過進一步系統全面的研究，愈來愈多的lncRNA會被發現，闡明lncRNA 繁雜的調節機制和功能靶標將會為心血管疾病的臨床診療提供最新的手段。