表告依春調(diào)控NF-kB 相關(guān)炎癥通路對骨肉瘤細胞惡性行為的抑制

趙 偉， 孟楨楨， 王 興

（三峽大學第三臨床醫(yī)學院，國藥葛洲壩中心醫(yī)院骨外科，宜昌 443003）

骨肉瘤是骨組織最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年或兒童，往往早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，預后不佳[1]。手術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療是主要的治療方案，但絕大多數(shù)患者仍由于腫瘤細胞耐藥及不良反應無法耐受導致治療失敗，尋找更安全的化合物作為聯(lián)合治療的輔助用藥將有助于改善這一困境。表告依春（epigoitrin，EPG）作為板藍根（radix isatidis，RI）提取物，被證實在體內(nèi)外發(fā)揮著抗病毒、抗炎及抗氧化應激等作用[2-3]，由于炎癥與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系[4-6]，EPG 也被發(fā)現(xiàn)參與惡性腫瘤的相關(guān)生物學過程[7]。本研究對EPG 在骨肉瘤細胞炎癥因子表達及惡性行為方面的影響進行了探究，同時通過成骨細胞模型評價EPG的潛在細胞毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自美國Gbico 公司，Epigoitrin 購自美國Selleck 公司，細胞裂解液及蛋白酶抑制劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，核因子-kB（nuclear factor kappa-B，NF-kB）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）抗體均購自美國proteintech 公司，CCK-8 試劑購自日本同仁化學研究所，Transwell 小室及Matrigel 基質(zhì)膠購自美國Corning 公司，β-Actin、NFkB、IL-1β 及TNF-α 單克隆抗體均購自美國proteintech 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人成骨細胞HOB 及骨肉瘤細胞U2OS，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2。分別接種對數(shù)生長期的HOB 及U2OS細胞于六孔板中，DMSO 稀釋EPG 至10 mmol·mL-1備用，將人成骨細胞HOB 分為正常0、200、400和800μmol·L-1組，分別使用0、200、400 和800μmol·L-1的EPG 處理24 h，將人骨肉瘤細胞U2OS 分為腫瘤0、200、400 和800 μmol·L-1組，同樣分別使用0、200、400 和800 μmol·L-1的EPG 處理24 h。

1.3 Western blot 檢測各組細胞蛋白表達水平

Ripa 裂解液+蛋白酶抑制劑收集各組細胞總蛋白，BCA 試劑檢測蛋白濃度，取30 μg 總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，穩(wěn)壓120 V，穩(wěn)流300 mA 轉(zhuǎn)PVDF 膜，10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，1∶2 000 β-Actin、NF-kB、IL-1β 及TNF-α 一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜3 次，10 min/次，相應二抗孵膜2 h，PBST 洗膜3 次，10 min/次，ECL 化學發(fā)光試劑孵育條帶，以β-Actin 為內(nèi)參基因，化學發(fā)光儀進行曝光顯影，采用Image LabTM圖像采集和分析軟件掃描條帶相對灰度。

1.4 CCK-8 實驗檢測各組細胞增殖能力

接種對數(shù)生長期細胞于96 孔板中，調(diào)整細胞濃度至2 000 個/孔，設(shè)置0、24、48、72 及96 h時間點，每組細胞設(shè)置5 個復孔，待細胞貼壁后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，避光培養(yǎng)4 h，多孔酶標儀檢測450 nm 處吸光度（OD）作為0 h 時OD 值，相同的方法檢測細胞24、48、72 及96 h后細胞OD 值，以各時間點與0 h 時間點的OD 值比值表示細胞相對增殖能力。

1.5 Transwell 實驗檢測各組細胞侵襲及遷移能力

侵襲能力檢測：使用1%FBS＋DMEM 重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至2×105個/mL，Matrigel 基質(zhì)膠以無血清DMEM 稀釋至50 mg·L-1鋪至Transwell小室上室面，37 ℃風干后無血清DMEM 水化5 min，200 μL 細胞懸液接種至Transwell 小室上室面，600 μL 10%FBS＋DMEM 加入24 孔板，將Transwell 小室放置于24 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)細胞48 h，上室面細胞用棉簽拭去后，PBS洗上室面3 次，無水乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，200×光鏡下計數(shù)，隨機統(tǒng)計從中間和周圍5 個視野的細胞數(shù)，計算平均值及標準差。遷移能力檢測：使用1%FBS＋DMEM 重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，200 μL 細胞懸液直接接種至Transwell 小室上室面，下室面加入10%FBS＋RPMI-1640（600 μL），培養(yǎng)24 h 后同樣進行固定及染色步驟，計數(shù)方法同前。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間比較，SNK-q檢驗進行多組間兩兩比較。檢驗水準α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞NF-kB、IL-1β 及TNF-α 的蛋白表達及比較

Western blot 結(jié)果顯示：與正常0 μmol·L-1組比較，腫瘤0 μmol·L-1組NF-kB、IL-1β 及TNF-α表達均升高（P 均＜0.01）；與正常0 μmol·L-1組比較，正常400 μmol·L-1組IL-1β 及TNF-α 表達均降低（P 均＜0.01），而正常800 μmol·L-1組NF-kB、IL-1β 及TNF-α 表達均降低（P 均＜0.01）；與腫瘤0 μmol·L-1組比較，腫瘤400 μmol·L-1和800 μmol·L-1組的NF-kB、IL-1β 和TNF-α 表達均降低（P 均＜0.01），腫瘤200 μmol·L-1組NF-kB和TNF-α 表達降低（P 均＜0.05），見圖1。

2.2 各組細胞相對增殖能力的比較

CCK-8 實驗結(jié)果顯示：與正常0 μmol·L-1組比較，正常200、400 和800 μmol·L-1在各時間點相對增殖能力差異均無統(tǒng)計學意義（P 均>0.05）；與腫瘤0 μmol·L-1組比較，腫瘤400 μmol·L-1和800 μmol·L-1組在72 h 和96 h 時細胞增殖能力降低（P＜0.01），腫瘤200 μmol·L-1組在96 h 時增殖能力降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組細胞相對增殖能力的比較

2.3 各組細胞侵襲能力的比較

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示：與正常0 μmol·L-1組比較，正常200、400 和800 μmol·L-1組侵襲能力差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）；與腫瘤0 μmol·L-1組比較，腫瘤200、400、800 μmol·L-1組侵襲能力均降低（P 均＜0.01），見圖3。

圖3 各組細胞侵襲能力的比較

2.4 各組細胞遷移能力的比較

Transwell 遷移實驗結(jié)果顯示：與正常0 μmol·L-1組比較，正常200、400、800 μmol·L-1組遷移能力差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）；與腫瘤0 μmol·L-1組比較，腫瘤200、400、800 μmol·L-1組遷移能力均減弱（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 各組細胞遷移能力的比較

3 討論

有研究證實EPG 在機體內(nèi)發(fā)揮抗炎及抗氧化作用：Xiao 等[2]利用高效液相色譜法測定發(fā)現(xiàn)RI 提取物中存在多種抗炎及抗氧化物質(zhì)，包括EPG，其生物利用度為18.28%；Huo 等[7]在肝細胞癌模型中發(fā)現(xiàn)EPG 可降低細胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，抑制細胞NF-kB 通路，提示EPG 的抗炎及抗氧化活性。炎癥對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，NF-kB、IL-1β及TNF-α 均被發(fā)現(xiàn)參與影響骨肉瘤細胞的惡性行為：NF-kB 被發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中高表達，并與抑癌基因染色體10 上缺失的磷酸酯酶與張力蛋白同源物基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）及患者的生存時間呈負性相關(guān)[8]，抑制NF-kB 信號通路后，骨肉瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力均顯著減弱，表明NF-kB 對骨肉瘤細胞惡性行為存在促進作用[9]，Lee 等[10]利用Amentoflavone 處理骨肉瘤細胞發(fā)現(xiàn)其可通過減弱NF-kB 的表達，進而抑制細胞的惡性表型。IL-1β 及TNF-α 作為NF-kB 的上游分子，可激活NF-kB 進而介導相應的生物學效應：Wang 等[11]發(fā)現(xiàn)干擾IL-1β 的表達后，骨肉瘤細胞PTEN 表達上調(diào)，同時細胞增殖能力減弱。Hu 等[12]研究顯示，IL-1β 可誘導激活NF-kB，介導miR-506 的抑制和鋸齒狀Notch經(jīng)典配體1（jagged canonical Notch ligand 1，JAG1）的上調(diào)，進而促進骨肉瘤細胞增殖；TNF-α 同樣被發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細胞中高表達，抑制TNF-α 可使NF-kB 活性降低，并下調(diào)細胞增殖、轉(zhuǎn)移及體內(nèi)成瘤的能力[13]。Liu 等[6]研究顯示，Ampelopsin可通過抑制TNF-α 的表達，介導骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的下降。上述研究表明，炎癥與骨肉瘤細胞惡性表型關(guān)系密切，且影響炎癥因子的表達可調(diào)控細胞惡性行為。

考慮到EPG 重要的抗炎作用，本研究以正常人成骨細胞及骨肉瘤細胞為體外模型衡量EPG的抗腫瘤作用及安全性，結(jié)果顯示，200 μmol·L-1EPG 可顯著下調(diào)骨肉瘤細胞NF-kB 相關(guān)炎癥因子的表達，抑制細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力，并與EPG存在量效關(guān)系，表明EPG 具有潛在的抗腫瘤價值；在200 μmol·L-1EPG 處理正常人成骨細胞時，NF-kB 相關(guān)炎癥因子表達無顯著變化，推測由于骨肉瘤細胞中NF-kB 相關(guān)炎癥因子表達處于異常激活的狀態(tài)[14]，導致其對EPG 的敏感性較高。同時800 μmol·L-1EPG 對人成骨細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力無顯著影響，表明EPG 細胞毒性較低，體外安全性較佳，可能是由于NF-kB 相關(guān)炎癥因子在維持正常人成骨細胞穩(wěn)態(tài)中不占主導地位，因此對EPG 敏感性差。后續(xù)將采用EPG 與化療藥物聯(lián)合處理骨肉瘤細胞，以期明確其輔助化療的潛在價值，為EPG 的臨床應用提供前期依據(jù)。