苯并[a]芘對人羊膜上皮細胞AQP-8 表達的影響

劉麗媛， 曹彩霞， 蔣 丹， 屈昱良， 賈詠存

（1.寧夏回族自治區人民醫院臨床檢驗診斷中心，銀川 750001； 2.寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川 750004）

羊水過少是一種常見的妊娠并發癥，會引起包括胎兒結構異常、生長受限以及各種出生后綜合征[1]。羊膜作為胎膜的組成部分，在維持羊水平衡中具有重要的作用，胎膜與羊水的吸收和母體與羊水的物質交換有密切的關系。此外，母體妊娠期間接觸的各種不良外界環境也會導致羊水過少[2]。苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）作為多環芳烴類的代表化合物廣泛存在于工作場所以及各種生活環境中，且可經口鼻等多種途徑進入人體[3]，可導致不育且影響女性生殖健康[4-5]，母體內高水平的BaP 代謝物可增加早孕期流產風險[6]。BaP 經代謝活化酶細胞色素P450 1A1（cytochrome P450 1A1，CYP1A1）作用形成7，8-氫二羥基-9，10-環氧化苯并［a］芘（benzo［a］pyren-7，8-dihydrodiol-9，10-epoxide，BPDE），干擾細胞內正常的信號通路，最終導致基因突變[7]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）普遍存在于與液體分泌和吸收有關的上皮細胞和內皮細胞，介導大量水快速被動地跨膜轉運，是水進出細胞的主要途徑[8]。其中水通道蛋白-8（AQP-8）[9]是存在于人羊膜上皮細胞上的主要蛋白。BaP 是否會改變調控羊水平衡的效應基因AQP-8 的表達鮮有報道，本研究旨在研究BaP 對人羊膜上皮細胞上AQP-8的表達影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

BaP（美國sigma 公司），兔抗人AQP-3、AQP-8、蛋白激酶A（PKA）、T-AKT、p-AKT、CYP1A1（南京bioworld 公司），鼠抗人GAPDH（美國sigma 公司），二抗羊抗兔lgG、羊抗小鼠lgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），人環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）（ELISA）試劑盒（英國abcam 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 選取2018 年9 月至2019 年12 月寧夏回族自治區人民醫院門診患者，所有病例均經本院倫理委員會批準，納入本研究的產婦均知情并簽署知情同意書。所有病例均無糖尿病、高血壓、胎兒畸形、胎兒生長受限、胎兒窘迫、胎膜早破、自身免疫疾病等妊娠合并癥和并發癥，無催產素引產史、藥物服用史等。依據羊水過少[10]的診斷標準：產前B 超監測羊水指數，正常羊水量的羊水指數范圍為8～18 cm，若羊水指數≤5 cm 為羊水過少。剖宮產術中進一步核實羊水量情況，實際羊水總量300～2 000 mL 為羊水正常，羊水總量＜300 mL 為羊水過少。收集羊水量正常的足月妊娠產婦羊膜組織20 例。無菌狀態下取選擇性剖宮產胎盤娩出后（10 min內）的羊膜組織，以無菌PBS 緩沖液以及無血清培養基反復沖洗備用。

1.2.2 人羊膜上皮細胞培養與純化 將羊膜組織從培養基（含雙抗無血清）取出并剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴箱消化45 min，等體積10%胎牛血清（FBS）的培養基終止消化，吹打均勻后1 500 r·min-1離心20 min 棄上清，重懸沉淀后800 r·min-1離心5 min 棄上清。細胞用含15%FBS 的培養基重懸，收集小部分細胞制作細胞爬片，鑒定為羊膜上皮細胞后，剩余細胞以密度為1×105個/mL 接種于培養瓶中，隔天換液，待融合度達90%傳代培養。

1.2.3 人羊膜上皮細胞分組與處理 BaP 為脂溶性物質，用二甲基亞砜（DMSO）溶解后配制，因此每組以DMSO 處理為對照組，不同濃度（0.1、1 和10 μmol·L-1）BaP 處理人羊膜上皮細胞12 h，最后一組用10 μmol·L-1毛喉素（Forskolin）前處理人羊膜上皮細胞2 h，10 μmol·L-1BaP 處理12 h，收集細胞備用。

1.2.4 Western blot 檢測人羊膜上皮細胞中的蛋白表達 Western blot 技術檢測人羊膜上皮細胞中AQP-8、CYP1A1、PKA、T-AKT 和p-AKT 的表達情況。操作步驟：刮取50 mL 培養瓶中人羊膜上皮細胞，加入200 μL 蛋白裂解液（碧云天）和2 μL 蛋白酶抑制劑PMSF（100 mmol·L-1），冰浴并振蕩裂解20 min，4 ℃（每5 min 振蕩1 次）、12 000 r·min-1離心15 min 后采用BCA 法進行蛋白定量。蛋白樣品（每支約50 μg）按4∶1 溶于5×上樣緩沖液中并混勻，煮沸10 min，10%SDSPAGE 凝膠電泳，恒壓80 V 電泳2 h；將蛋白質電轉至PVDF 膜上，3%BSA 由PBST 液（Tween20∶PBS 為1∶2 000）配制室溫封閉1 h；然后分別孵一抗AQP-3、AQP-8、T-AKT、p-AKT、PKA、CYP1A1、GAPDH（抗體與3%BSA 比例為1∶1 000），37 ℃孵育3 h，PBST 洗滌5 min 并重復3 次。用3%BSA稀釋的二抗室溫孵育1 h，PBST 洗滌5 min 并重復3 次后化學發光ECL 法顯影觀察條帶。Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.5 MTT 法檢測細胞活力 取對數生長期細胞，以每孔5×103個細胞200 μL 培養基接種于96 孔板，培養12 h 后，以含不同濃度（0.1、1、10、50 和100 μmol·L-1）BaP 培養基處理12 h。吸去培養基，每孔以100 μL 含MTT 培養基（1 mg·mL-1）培養4 h。吸去上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在492 nm 波長下測其吸光度（A）值。應用公式計算：細胞存活率（%）=（實驗組平均A 值/對照組平均A 值）×100%。

1.2.6 ELISA 檢測人羊膜上皮細胞內cAMP 含量 收集各組人羊膜細胞后超聲裂解，取上清液。按照ELISA 試劑盒的說明書操作，測定各組細胞中cAMP 的含量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t 檢驗或單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同BaP 對人羊膜上皮細胞活力的影響

MTT 結果顯示，不同濃度BaP（0.1、1、10、50 和100 μmol·L-1）處理人羊膜上皮細胞12 h，與對照組相比，BaP 處理組細胞活力呈下降趨勢（F=1 202.643，P＜0.01），細胞活力隨著處理濃度的增加而下降（P 均＜0.05），見圖1。

圖1 MTT 檢測不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞活力的影響

2.2 不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞AQP-3、AQP-8、CYP1A1 表達的影響

Western blot 結果表明，不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞AQP-3 表達無影響（P＞0.05）；CYP1A1表達量隨著BaP 濃度的增加而上調（F=96.689，P＜0.01）；AQP-8 表達量隨著BaP 濃度的增加而下調（F=35.092，P＜0.05），見圖2。

圖2 不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞CYP1A1、AQP-3、AQP-8 表達的影響

2.3 不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞PKA 和p-AKT 表達的影響

Western blot 結果表明，不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞p-AKT/T-AKT 值無影響（以T-AKT為內參計算比值）（P＞0.05）。不同濃度BaP（0.1、1、10 μmol·L-1）處理組與對照組比較差異均有統計學意義（P 均＜0.05），與對照組相比，BaP 處理組PKA表達量逐漸下降（F=106.999，P＜0.01），見圖3。

圖3 不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞p-AKT、PKA 表達的影響

2.4 不同濃度BaP 對人羊膜上皮細胞裂解液中cAMP 含量的影響

ELISA 結果表明，（0.1、1、10 μmol·L-1）BaP 處理組與對照組比較差異有統計學意義，對照組［（61.73±2.11）μmol·L-1］、0.1 μmol·L-1BaP 處理組［（56.90±1.44）μmol·L-1］、1 μmol·L-1BaP 處理組［（46.80±1.47）μmol·L-1］、10 μmol·L-1BaP 處理組［（40.87±1.07）μmol·L-1］中cAMP 表達量均下降（F=56.729，P均＜0.05）。與0.1 μmol·L-1BaP處理組相比，1μmol·L-1BaP 處理組、10 μmol·L-1BaP處理組cAMP 表達量均下降（P 均＜0.05）。與1 μmol·L-1BaP 處理組相比，10 μmol·L-1BaP處理組cAMP 表達量下降（P＜0.05）。

2.5 cAMP 激活劑Forskolin 與BaP 處理下對人羊膜上皮細胞AQP-8、PKA 表達的影響

Western blot 檢測結果顯示：AQP-8、PKA 在10 μmol·L-1BaP 和Forskolin 聯合處理下與對照組比較差異均無統計學意義（P 均＞0.05）。與對照組相比，AQP-8、PKA 表達均下調（P 均＜0.01）；與10 μmol·L-1BaP 處理組相比，AQP-8、PKA 表達也均上調（P均＜0.01），見圖4。

圖4 10 μmol·L-1 BaP 和Forskolin 對人羊膜上皮細胞AQP-8、PKA 的表達情況

2.6 cAMP-PKA 信號通路激活劑Forskolin 與BaP 處理下cAMP 濃度變化

ELISA 檢測結果顯示：與對照組［（61.57±2.04）μmol·L-1］相比，10 μmol·L-1BaP 組cAMP［（50.50±2.30）μmol·L-1］下降（P＜0.01），與10 μmol·L-1BaP和Forskolin 聯合組［（57.6±2.14）μmol·L-1］相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。與10 μmol·L-1BaP處理組相比，10 μmol·L-1BaP 和Forskolin 聯合組［（57.60±2.14）μmol·L-1］cAMP 上升（P＜0.01）。

3 討論

妊娠期間正常的羊水量對維持胎兒生長發育至關重要。除胎兒結構異常、胎盤功能減退、過期妊娠、羊膜病變以及母體妊娠高血壓或免疫性因素等能夠引起羊水過少的原因外[10]，妊娠期間暴露于環境污染物中，也會引起羊水過少[11]。

BaP 是一種持久性的有機污染物，其在體內代謝過程中合成細胞色素P450 酶家族，該家族包括CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1 等。其中CYP1A1在解毒方面占據重要地位[12]，也是BaP 在體內進行代謝的重要指標。在哺乳動物體內，BaP 在CYP1A1 的作用下代謝成BPDE，后者與DNA 結合形成共價化合物從而引起DNA 損傷、突變[13]。

妊娠期間，有50%的羊水是通過羊水的膜內吸收途徑直接進入胎兒血液循環[14]，該途徑由覆蓋在胎盤表面的羊膜、絨毛膜參與，包括兩種形式，即以囊泡運輸形式的主動轉運和AQPs 介導的被動轉運。AQPs[15]為一類小分子膜蛋白（約30 kD），因其可增加質膜脂質雙分子層的水通透性而得名。目前在哺乳動物中共發現13 種AQPs，即AQP-0～AQP-12。其中有5 種表達于人羊膜，分別是AQP-1、AQP-3、AQP-8、AQP-9 和AQP-11，這點與我們的研究結果一致。AQP-8 是經典AQPs 亞群，對水具有高度選擇性，能促進尿素的轉運，但對甘油無通透性，其主要表達于消化系統、生殖系統、泌尿系統及呼吸系統等。

本研究中，為了研究環境污染物BaP 對羊膜組織AQP-8 表達降低的作用機制，分離培養了羊膜組織的原代細胞建立體外模型。人羊膜上皮細胞是胎盤羊膜組織靠近胎兒側的單層上皮細胞[16]，從羊膜分離的人羊膜上皮細胞可在體外進行傳代培養，可傳代5～6 次。因人羊膜上皮細胞無致瘤性、低免疫原性，系產后廢棄物，又不涉及社會和生命倫理學問題，是研究羊水過少機制的最佳細胞模型。

本研究發現，用BaP 處理過的人羊膜上皮細胞，AQP-8 的表達呈劑量依賴性降低，且CYP1A1 呈劑量依賴性升高，表明了BaP 可激活并通過CYP1A1 代謝改變AQP-8 的表達水平。BaP 在體內可影響多種信號通路，其中研究最多的為MAPK[6]、PI3K/AKT[17]、cAMP-PKA[18]等信號通路。有研究[19]表明，cAMP-PKA 信號通路調控了人羊膜上皮細胞中AQP-8 的表達，PI3K/AKT信號通路參與調控AQPs 的表達。因此本研究選擇這兩個信號通路上的關鍵分子進行研究。在本研究中發現，p-AKT 的表達并沒有隨著BaP 的改變而發生變化，而細胞內cAMP 的濃度與PKA的蛋白表達水平卻隨著BaP 的變化發生劑量依賴性改變，因此認為BaP 可能是通過影響cAMPPKA 信號通路而改變AQP-8 的表達。

cAMP 作為細胞內重要的第二信使[20]，可調控細胞的多種功能。cAMP 的激活劑Forskolin可作用于細胞，通過激活腺苷酸環化酶而增加細胞內cAMP 含量。cAMP-PKA 信號傳導通路是一條經典的信號通路，是細胞內水液平衡信號轉導的主要途徑，cAMP 通過激活PKA，促使cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）磷酸化，磷酸化CREB可以調節基因轉錄，從而調節細胞的增殖、分化與凋亡等。為了進一步證實本研究的結論，本研究應用Forskolin 前處理人羊膜上皮細胞，發現PKA、AQP-8 的蛋白水平以及cAMP 的濃度比起未被Forskolin 處理過的細胞，其表達有所提高，更進一步證實了BaP 是通過cAMP-PKA 信號通路調節AQP-8 的表達從而影響羊水平衡。

綜上所述，本研究表明了環境污染物BaP 參與了羊水過少發生的機制。在體外細胞水平BaP通過影響cAMP-PKA 信號通路改變了AQP-8 的表達，可能是影響羊水量過少發生的機制之一，當然該過程也可能涉及其他信號通路以及分子的參與，其作用機制可能是錯綜復雜的。