硫酸鈹誘導(dǎo)人肺腺癌A549 細(xì)胞纖維化中細(xì)胞因子的變化

戚發(fā)秋， 王 凱， 陳小惠， 劉紅婭， 趙 楓， 付有娟， 關(guān)素珍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

鈹是一種硬質(zhì)銀灰色稀有金屬，由于其優(yōu)異的性能而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域[1]。隨著工業(yè)的發(fā)展，對(duì)鈹?shù)男枨笱杆僭黾樱馕吨鳂I(yè)人群的接觸機(jī)也隨之增加。鈹及其化合物是全身毒物，可通過(guò)皮膚、黏膜和呼吸道暴露于人體，并在肺部積累[2]。短期過(guò)度接觸可能導(dǎo)致急性化學(xué)性肺炎，長(zhǎng)期職業(yè)接觸低水平鈹?shù)墓と耸軗p害器官和組織可能會(huì)逐漸出現(xiàn)纖維增殖反應(yīng)或慢性鈹病（chronic beryllium disease，CBD）[3]。肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一類以肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積為主要病理特征的不可逆性疾病[4]。目前CBD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β是一種明確的致多種器官纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本研究以硫酸鈹（BeSO4）處理離體培養(yǎng)人A549細(xì)胞構(gòu)建纖維化模型，并通過(guò)檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-Ⅰ，COL-Ⅰ）和Ⅲ型膠原蛋白（collagen-Ⅲ，COL-Ⅲ）的相對(duì)表達(dá)含量來(lái)驗(yàn)證，為鈹及其化合物致PF 機(jī)制的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞（A549 細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（FBS，以色列BI 公司）；細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM，以色列BI公司）；磷酸鹽緩沖液（美國(guó)HyClone 公司）；Be－SO4·4H2O（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）。兔抗人α-SMA、TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；β-actin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔標(biāo)記IgG（武漢亞科因生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒 A549 細(xì)胞用10%胎牛血清和1%雙抗的Dulbecco＇s 改良高糖DMEM，常規(guī)培養(yǎng)于37.0 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，2 d 換液1次，用胰蛋白酶在細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基制成均勻細(xì)胞懸液，以500 個(gè)/孔密度接種于96 孔板中，分別加入濃度為0、1、10、50、100、150 μmol·L-1BeSO4的100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，分別染毒24、48 和72 h。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)A549 細(xì)胞活性 BeSO4染毒24、48 和72 h 后，更換培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8 檢測(cè)溶液，于37.0 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，最終以BeSO4終濃度為1、10 和100 μmol·L-1設(shè)置低、中、高劑量組，空白對(duì)照組加入100 μL高糖DMEM 處理。每組細(xì)胞均設(shè)3 個(gè)樣品，常規(guī)培養(yǎng)于37.0 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，以不同劑量BeSO4處理細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞，用于總蛋白提取。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入培養(yǎng)基制成均勻細(xì)胞懸液，以5 000 個(gè)/孔的密度種入6 孔板中，用不同濃度的BeSO4處理48 h 后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 TGF-β1 及其他纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 細(xì)胞總蛋白提取后按二辛可寧酸（BCA）蛋白定量法檢測(cè)總蛋白濃度，采用聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，300 mA 轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間由分子質(zhì)量確定，轉(zhuǎn)膜完畢后用含5%脫脂奶粉的Tris-Hcl 緩沖液（TBST）封閉1 h 后，用特異性一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST 液洗滌3 次，二抗孵育1 h，PBST 洗滌3 次，最后采用Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，并用凝膠圖像Image J 軟件測(cè)定灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BeSO4 對(duì)A549 細(xì)胞活性的影響

不同濃度（0、1、10、50、100、150 μmol·L-1）BeSO4干預(yù)A549 細(xì)胞72 h 后，與空白對(duì)照組相比，BeSO4各濃度組細(xì)胞活力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。且細(xì)胞活力與BeSO4濃度呈負(fù)相關(guān)，隨著B(niǎo)eSO4濃度增加，細(xì)胞活力逐漸減小。根據(jù)回歸方程y=-0.0 028x+0.8 886（R2=0.9 874）計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（IC50）為138.79 μmol·L-1，確定0、1、10、100 μmol·L-1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，見(jiàn)圖1。不同濃度BeSO4染毒24、48、72 h 后，細(xì)胞活力隨著染毒時(shí)間的增加逐漸降低，見(jiàn)圖2。同時(shí)觀察100 μmol·L-1BeSO4染毒不同時(shí)間細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，與空白對(duì)照組相比，染毒24 h 后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，染毒72 h 后細(xì)胞形態(tài)較差且生長(zhǎng)緩慢，染毒48 h 后細(xì)胞形態(tài)改變較為明顯且細(xì)胞狀態(tài)較好，所以最終選取48 h 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的染毒時(shí)間，見(jiàn)圖3。

圖1 不同濃度BeSO4 處理A549 細(xì)胞72 h 后細(xì)胞活力曲線

圖2 BeSO4 處理A549 細(xì)胞24、48、72 h 后細(xì)胞活力變化

圖3 100 μmol·L-1BeSO4 處理A549 細(xì)胞后不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)變化（×200）

2.2 細(xì)胞形態(tài)變化

不同濃度BeSO4染毒A549 細(xì)胞48 h 后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，空白對(duì)照組A549 細(xì)胞以上皮細(xì)胞狀態(tài)生長(zhǎng)，細(xì)胞均勻生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)良好，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有2～5 個(gè)樹(shù)杈樣突起，細(xì)胞核形態(tài)清晰。BeSO4組隨著B(niǎo)eSO4濃度的升高，逐漸停止增殖，且隨著B(niǎo)eSO4濃度增加，細(xì)胞核固縮，突起減少，并且細(xì)胞數(shù)量變少，見(jiàn)圖4。

圖4 BeSO4 處理A549 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞形態(tài)變化（×200）

2.3 不同劑量BeSO4 處理A549 細(xì)胞中TGF-β1及其他纖維化相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)量

不同劑量BeSO4處理A549 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞中TGF-β1 及其他纖維化相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈升高趨勢(shì)（P 均＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，低劑量組α-SMA、TGF-β1、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別增長(zhǎng)了0.23、0.38、0.26和0.48 倍，中劑量組α-SMA、TGF-β1、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別增長(zhǎng)了0.40、0.93、0.42 和0.95 倍，高劑量組α-SMA、TGFβ1、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別增長(zhǎng)了0.69、1.24、0.62 和1.31 倍（P 均＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 BeSO4 處理A549 細(xì)胞48 h 后相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)和灰度分析情況

3 討論

本研究通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)不同濃度BeSO4干預(yù)A549 細(xì)胞不同時(shí)間后其細(xì)胞活力改變，結(jié)果表明，低濃度短時(shí)間BeSO4暴露能促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，但隨著B(niǎo)eSO4濃度和作用時(shí)間增加，A549 細(xì)胞的活力逐漸降低，且有明顯的濃度和時(shí)間依賴性，說(shuō)明BeSO4具有細(xì)胞毒性作用，對(duì)于A549 細(xì)胞活力有抑制作用。此外，有研究[7]表明，生物化學(xué)刺激能引起肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生釋放多種細(xì)胞因子，其中TGF-β 被認(rèn)為與PF 的發(fā)生和形成關(guān)系最為密切，是纖維化病變的起始因子。TGF-β 是一種已知的生長(zhǎng)因子，可調(diào)節(jié)許多基本的細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡[8]。該生長(zhǎng)因子的主要哺乳動(dòng)物亞型為TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3，其中TGF-β1與PF 的發(fā)展關(guān)系最為密切[9]。TGF-β1 通過(guò)與其受體結(jié)合，形成跨膜復(fù)合體才能發(fā)揮纖維化生物學(xué)效應(yīng)，主要通過(guò)激活其下游效應(yīng)分子Smads 家族而介導(dǎo)信號(hào)通路的傳導(dǎo)[10]。通過(guò)TGF-β/Smad通路，TGF-β1 可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)ECM 在肺間質(zhì)大量形成并導(dǎo)致纖維化[11]。

ECM 是PF 發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的病理特征[12]。大部分ECM 的合成和分泌由肺成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞完成，其過(guò)度沉積可導(dǎo)致不可逆的PF，而COL-Ⅰ和COL-Ⅲ是ECM 的重要構(gòu)成成分[13-14]。有研究[15]顯示，在外界致纖維化因子的作用下，肺成纖維細(xì)胞不斷增殖并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其分化標(biāo)志是大量表達(dá)α-SMA。本研究結(jié)果顯示，在BeSO4作用48 h 后，A549 細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和TGF-β1 的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均呈隨處理劑量增加而增加的趨勢(shì)，與劉科良等[16]的研究結(jié)果一致，表明A549 細(xì)胞在BeSO4作用下發(fā)生纖維化，但其中下游效應(yīng)分子Smads 的改變及其影響因素尚不明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步深入探討。