川楝素對胃癌細胞糖酵解效應的影響及相關機制

李錫丁，周永平，李旻昊，范新奇

(南京醫科大學附屬無錫第二醫院 1.普外科； 2. 肝膽外科，江蘇 無錫 214002)

川楝素是從傳統中藥楝屬植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環三萜類化合物，具有良好的抗腫瘤作用，是一種極具潛力的抗癌藥物[1]。既往文獻表明川楝素可抑制胃癌細胞的惡性表型，并促進胃癌細胞凋亡[2-3]。惡性腫瘤是一種以逃避細胞增殖檢查點為特征的疾病。即使在氧氣存在的情況下，癌細胞也可將葡萄糖代謝重新編程為有氧糖酵解方式，以替代常規的氧化磷酸化途徑來供給能量[4]。腫瘤細胞常通過調控葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP合成等代謝方式，發揮其增殖、侵襲、轉移和逃逸等惡性潛能，有助于其在腫瘤進展期間無限地增殖和存活[5-6]。研究提示，胃癌細胞在惡性轉化的過程中，細胞的代謝模式會從氧化磷酸化轉化為有氧糖酵解以滿足更多的能量需求[7]。

線粒體NAD依賴性脫乙酰酶Sirtuin-3(SIRT3)是一種腫瘤抑制因子，是有氧糖酵解的關鍵調節劑，可通過缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)抑制糖酵解效應，進而抑制葡萄糖轉運蛋白1 (glucose transporter 1，GLUT1)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase A，LDHA)等糖酵解關鍵調控因子的表達，抑制腫瘤的惡性生物學行為[8]。信號傳導與轉錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一種具有促癌功能的轉錄因子。研究表明，STAT3/SIRT3/HIF-1α信號軸在卵巢癌細胞的增殖和糖代謝重塑等惡性表型中可發揮重要調控作用[9]。既往有研究報道，STAT3是川楝素的潛在作用靶點[10]。為探究川楝素是否通過STAT3/SIRT3/HIF-1α信號軸抑制腫瘤細胞糖酵解效應，本研究擬從糖代謝角度探討川楝素對胃癌細胞中糖酵解效應的影響，及其對STAT3/SIRT3/HIF-1α信號通路的調節作用。

1 材料和方法

1.1 組織標本、細胞及主要試劑

收集2020年4月至10月在南京醫科大學附屬無錫第二醫院通過手術切除的31例胃癌患者的石蠟包埋胃癌組織切取片。所有患者術前均未曾接受任何治療，術后通過病理診斷證實為胃腺癌。

胃癌AGS和HGC-27細胞購自中國科學院細胞庫(北京)。根據既往文獻報道[11]購買同一批次川楝素，購自武漢ChemFaces公司。將川楝素溶于二甲基亞砜中，制成10 mol/L溶液，于-20 ℃儲存備用。葡萄糖吸收和乳酸生成分析試劑盒均為美國Biovision公司產品；pRL-TK、pGL3-control 載體、雙熒光素酶檢測試劑盒為美國Promega公司產品；LipofectamineTM轉染試劑購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1(+)質粒和pcDNA3.1(+)-STAT3質粒購自蘇州泓迅生物科技有限公司，并經測序證實；大腸埃希菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司；STAT3(人抗兔單抗)、SIRT3 (人抗兔多抗)和HIF-1α (人抗兔單抗)一抗均為英國Abcam公司產品；DAB染色液、二抗試劑盒和抗原修復液購自福州邁新生物開發有限公司；總RNA抽提、逆轉錄試劑盒和熒光實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.2 免疫組織化學法檢測SIRT3、STAT3和HIF-1α表達

將甲醛固定和石蠟包埋的標本行5 μm切片。經二甲苯浸泡10 min脫蠟、無水乙醇浸泡5 min、95%乙醇浸泡5 min和70%乙醇浸泡5 min水化。隨后分別用0.3%過氧化氫和10 %正常山羊血清封閉15 min，蒸餾水搖洗3遍(3 min/次)。在沸水中加入EDTA(pH 8.0)枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)浸泡5 min后使用高壓熱修復10 min。切片與抗體(STAT3 1 ∶1 000，SIRT3 1 ∶500，HIF-1α 1 ∶100)孵育過夜；用0.01 mol/L PBS徹底洗滌。加入相應的鼠抗兔二抗工作液，室溫孵育30 min。以不加一抗、不加二抗以及一抗和二抗均不加作為陰性對照。最后用DAB染色，鏡下控制顯色，保證顯色時間基本一致。切片浸入自來水中終止顯色反應，蘇木精復染15 s，自來水沖洗返藍30 min，脫水封片。免疫組化切片經3D HISTECH數字切片掃描系統(匈牙利3D HISTECH公司)掃描后，采用3D HISTECH定量Center2.1分析軟件計算棕色區域(陽性區域)和藍色區域(陰性區域)的面積和灰度值，通過總灰度值計算積分光密度值(integral optical density，IOD)，最后將IOD除以圖片陽性面積得到最終指標平均光密度值(mean optical density, MOD)[11]。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養及分組 胃癌AGS和HGC-27細胞復蘇后以2×106/mL密度接種在25 cm2細胞培養瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37 ℃和5 % CO2培養箱中培養；細胞隔天換液至生長達80%～90%時，用0.1%胰酶消化并傳代，選取對數生長期的細胞用于實驗。細胞設立溶劑對照組和2個不同濃度的川楝素處理組。分別給予DMSO、100 nmol/L川楝素和250 nmol/L川楝素處理24 h[12]，藥物濃度經預實驗確定有效。

1.3.2 葡萄糖和乳酸水平檢測 用BioProfile FLEX分析儀(美國諾華生物醫學)和乳酸試劑盒測量培養基中的葡萄糖和乳酸水平，并將其標準化為細胞數。在新鮮培養基中加入細胞孵育30～60 min，測量培養基中乳酸鹽水平(乳酸鹽試劑盒)，并將其標準化為每個細胞的數量。

1.3.3 qRT-PCR檢測GLUT1mRNA和LDHAmRNA表達 抽提胃癌細胞內總RNA，逆轉錄后進行qRT-PCR。STAT3上游引物：5′-GGAGGAGGCATTCGGAAAG-3′，下游引物：5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3；SIRT3上游引物：5′-CCATCGGAAGGACTAGGTGTCT-3′，下游引物：5′-GGCTTGGGGTTGTGAAAGAAG-3′；HIF-1α上游引物：5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3′，下游引物：5′-CCATCGGAAGGACTAGGTGTCT-3′。GLUT1上游引物：5′-AACTC TTCAGCCAGGGTCCA-3′，下游引物：5′-CACAGTGAAGATGATGAAGAC-3′；LDHA上游引物：5′-GGAGATTCCAGTGTGCCTGT-3′，下游引物：5′-GTCCAATAGCCCAGGATGTG-3′；β-肌動蛋白上游引物：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。20 μL反應體系包含：Master混合物10 μL，酶混合物1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，探針1 μL，RNA模板6 μL。擴增條件：50 ℃逆轉錄30 min，95 ℃初始化15 min，94 ℃變性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30～35個循環，72 ℃ 10 min。反應完成后首先查看每個基因的熔解曲線是否為單峰和擴增情況，導出相應的閾值循環數(Ct值)，采用2-△△Ct法計算實驗組(川楝素處理)與對照組(DMSO處理)之間基因表達量的差異。

1.3.4 熒光素酶報告基因實驗測定SIRT3啟動子轉錄活性 從http://dbtss.hgc.jp網站數據庫檢索獲得SIRT3啟動子序列的-2000～+100部分序列，設計啟動子引物序列，并在上游引物5′端加入KpnⅠ酶切位點GGTACC，在下游引物5′端加入HindⅢ酶切位點AAGCTT。

收集對數生長期HGC-27細胞約1×107個，DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以HGC-27細胞基因組DNA為模板，PCR擴增獲得SIRT3啟動子條帶，參照試劑盒的操作說明回收并純化。將SIRT3的人啟動子序列作為pGL3-SIRT3-promoter插入pGL3-基本載體中。在鋪有AGS和HGC-27細胞的6孔板中轉染pGL3-SIRT3質粒(100 ng)和Renilla對照質粒(5 ng)。將細胞分為3組，2個川楝素處理組和對照組，分別加入250 nmol/L川楝素、250 nmol/L川楝素和等體積DMSO溶劑。其中一組川楝素處理細胞轉染STAT3過表達質粒(5 ng)。在轉染后48 h采用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性。報告熒光素酶活性基于海腎熒光素酶標準化，然后重新調整為單位等于1的載體對照信號。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 STAT3/SIRT3/HIF-1α信號軸蛋白在胃癌組織中的表達

免疫組織化學結果顯示，在胃癌組織中，可觀察到STAT3和HIF-1α蛋白在腫瘤細胞核中整體表現為陽性或強陽性，而SIRT3在腫瘤細胞核中整體表現為陽性或弱陽性(圖1)。

分析三者表達的MOD值，結果顯示，SIRT3免疫染色表達與STAT3 (r=-0.425，P=0.017)和HIF-1α (r=-0.513，P=0.003)呈負相關，而STAT3和HIF-1α (r=0.598，P=0.001)的免疫染色表達呈正相關。見圖2。

圖1 免疫組織化學法檢測胃癌組織中SIRT3、STAT3和HIF-1α蛋白表達(×100)

圖2 胃癌組織中SIRT3、STAT3和HIF-1α蛋白表達的相關性分析

2.2 川楝素對胃癌細胞糖酵解效應的影響

與對照組比較，100 nmol/L、250 nmol/L川楝素作用于AGS和HGC-27 細胞后，胃癌細胞葡萄糖相對吸收值和相對乳酸生成量明顯降低(P均<0.01)。與100 nmol/L川楝素處理組比較，250 nmol/L川楝素處理組胃癌AGS和HGC-27 細胞葡萄糖相對吸收值和相對乳酸生成量明顯降低(P均<0.01)。見圖3。

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與100 nmol/L川楝素比較

2.3 川楝素對胃癌細胞GLUT1和LDHA mRNA表達的影響

結果顯示，與對照組比較，100 nmol/L、250 nmol/L川楝素組AGS、HGC-27胃癌細胞GLUT1mRNA和LDHAmRNA表達明顯降低(P<0.05或<0.01)。與100 nmol/L川楝素組比較，250 nmol/L川楝素組AGS、HGC-27胃癌細胞GLUT1、LDHAmRNA表達明顯降低(P均<0.01)。見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.01，與100 nmol/L川楝素比較

2.4 川楝素對胃癌細胞STAT3、SIRT3和HIF-1α mRNA表達的影響

與對照組相比，100 nmol/L、250 nmol/L川楝素組AGS和HGC-27胃癌細胞STAT3、HIF-1αmRNA表達明顯降低(P均<0.01)，SIRT3mRNA表達明顯增強(P均<0.01)。與100 nmol/L川楝素處理組比較，250 nmol/L川楝素處理組胃癌細胞STAT3和HIF-1αmRNA表達明顯降低(P均<0.01)，SIRT3mRNA表達明顯增強(P均<0.01)。見圖5。

a：P<0.01，與對照組比較；b： P<0.01，與100 nmol/L川楝素比較

2.5 川楝素通過抑制STAT3來上調SIRT3啟動子活性

上述實驗結果顯示，高濃度川楝素(250 nmol/L)在胃癌細胞中的調控作用更顯著，所以本實驗選用高濃度川楝素處理細胞。結果顯示，川楝素處理明顯升高AGS和HGC-27細胞中SIRT3啟動子誘導的熒光素酶活性(P<均0.01)；而在川楝素處理的AGS和HGC-27細胞中導入STAT3質粒，與川楝素處理組比較，過表達STAT3則可從一定程度降低川楝素對SIRT3啟動子誘導的熒光素酶活性的促進作用(P均<0.01)。見圖6。

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與250 nmol/L川楝素比較

3 討論

HIF-1α是控制糖酵解基因表達的轉錄因子，而線粒體NAD依賴性脫乙酰酶SIRT3是一種腫瘤抑制因子，SIRT3作為Warburg效應的關鍵調節劑，通過使HIF-1α不穩定來介導代謝重編程，進而調控GLUT1和LDHA等糖酵解關鍵調控因子表達，抑制腫瘤的惡性生物學行為[8]。本研究檢測發現STAT3、SIRT3和HIF-1α蛋白均在胃癌組織中表達，而且SIRT3蛋白表達與STAT3和HIF-1α表達呈負相關，STAT3和HIF-1α蛋白表達呈中度相關，提示STAT3/SIRT3/HIF-1α信號通路可能參與胃癌細胞糖代謝的調控。

根據既往文獻報道[12]，本研究中分別選用低濃度100 nmol/L和高濃度250 nmol/L的川楝素處理胃癌細胞。選用兩株胃癌細胞(AGS細胞和HGC-27細胞)，以證實相關影響在胃癌細胞中的普遍性。結果顯示，川楝素均可抑制葡萄糖攝取和乳酸生成，抑制糖酵解關鍵調控因子GLUT1mRNA和LDHAmRNA表達，高濃度川楝素可獲得更強的抑制效果。由此提示，川楝素可呈一定濃度依賴性降低胃癌細胞中的糖酵解水平。

既往研究表明，川楝素可通過調節具有促癌功能的轉錄因子STAT3實現抗腫瘤抑制作用[10]。本研究發現，川楝素可以抑制STAT3和HIF-1αmRNA表達，促進SIRT3mRNA表達，且川楝素濃度越高調控效果越強。利用川楝素處理胃癌細胞，可促進SIRT3啟動子的活化，但在川楝素處理的胃癌細胞中過表達STAT3則可以部分削弱川楝素的作用。由此表明，川楝素通過上調SIRT3啟動子活性促進SIRT3轉錄表達；過表達STAT3可以抑制川楝素對SIRT3啟動子的活化作用。

綜上所述，川楝素可通過介導STAT3表達影響SIRT3/HIF-1α調控軸，繼而抑制胃癌細胞糖代謝水平。但是，川楝素是否通過糖代謝相關分子途徑影響胃癌細胞侵襲、轉移和凋亡等惡性表型，需要進一步探討。