牛蛙替代蟾蜍在生理教學實驗中的應用研究*

徐彩云 李天舒 李曉慧 于慧美 郭新榮 張大維 崔佳潤

(1.吉林大學基礎醫學院，長春 130021；2.吉林大學第二醫院，長春 130000)

根據周辰[1]報道，蟾蜍是醫學生理學實驗中傳統的實驗用動物，可利用其開展蛙心灌流、神經干動作電位測定、神經和肌肉標本制作等實驗，但我國的野生動物保護法規定捕捉蟾蜍是違法的行為。因此，依據實驗動物“3R”原則，選取能夠替代蟾蜍的實驗用動物和實驗方法，以實現既能滿足醫學教學需要，又能符合法律法規[2-4]。牛蛙與蟾蜍同屬于兩棲綱(Amphibian)無尾目(Anura)，在遺傳分類學及結構性能方面均非常接近，而且牛蛙屬于經濟動物，人工養殖、來源廣泛，質量可以得到有效保障[5-7]。本研究探討采用牛蛙替代蟾蜍開展生理學實驗的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:牛蛙20只，雌雄不限，體質量80～100 g，50～60 日齡，購于A水產批發市場；蟾蜍20只，雌雄不限，體質量40～60 g，2年齡，購自九臺區東湖街道辦事處恒達養殖業農民專業合作社，實驗動物使用許可證號：SYXK(吉)2017-0003。實驗通過吉林大學基礎醫學院倫理委員會實驗動物福利倫理審查，編號：(2021年)研審第(0175)號。

1.1.2試劑與儀器:主要試劑與儀器：重酒石酸去甲腎上腺素(NA)購自遠大醫藥(中國)有限公司；氯化乙酰膽堿(Ach)購自山東西亞化學有限公司；無水氯化鈣(CaCl2)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、乳酸(LA)及氯化鈉(NaCl)購自北京化工廠有限責任公司；BL-420e實驗系統、標本屏蔽盒及張力傳感器購自成都泰盟軟件有限公司。

1.2 方法

1.2.1蛙心灌流實驗牛蛙和蟾蜍離體蛙心制備：①用刺蛙針搗毀實驗用動物脊髓及腦；②解剖、暴露心臟，并剪開心包；③心臟插管，用動脈下方備用線結扎玻璃插管；④將心臟離體，固定在多功能鐵架臺上。在心臟舒張時，夾住心尖，將蛙心夾上的線連接張力傳感器著力點上[8-10]，并連接BL-420e機能實驗系統，進行動態監測離體心臟的收縮曲線。

不同離子、藥物及酸堿的對離體蛙心收縮情況的影響：換掉玻璃管內的所有灌流液加入0.65%NaCl溶液，監測收縮曲線，用新配制的林格氏液沖洗插管至心臟收縮曲線恢復正常。滴加兩滴3%CaCl2溶液于灌流液中，監測曲線變化。重復上述步驟，曲線正常后依次加入：1%KCl溶液、0.001% NA溶液、0.001% Ach溶液及3%LA溶液,各兩滴于灌流液中，效果明顯后，再加兩滴2.5%NaHCO3溶液，監測曲線并用灌流液沖洗至曲線恢復正常。

1.2.2坐骨神經-腓腸肌收縮與刺激強度和刺激頻率的關系

①骨骼肌標本制作；②標本固定于屏蔽盒內；③連接儀器。用經任氏液潤濕的銅鋅弓刺激牛蛙或蟾蜍坐骨神經-腓腸肌標本。收縮反應迅速發生，表明標本制備成功[11]。啟動系統，分別進行實驗記錄與觀察。

1.2.3神經干動作電位傳導速度的測定：將完成制備的牛蛙及蟾蜍坐骨神經干標本置于標本屏蔽盒的電極上，近心端與刺激電極接觸，遠心端與引導電極相連[12]，并連接生物機能實驗系統，刺激神經產生動作電位，測量兩對引導電極間的距離(s2-s1)及兩個通道的動作電位波峰間的時間差(t2-t1)，則傳導速度為：v=(s2-s1)/(t2-t1)

統計學數據，組間進行t檢驗，P>0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 蛙心灌流實驗結果

2.1.1離子對心臟收縮的影響:沒有離子刺激時，離體心臟節律性跳動。牛蛙及蟾蜍離體心臟分別由林格氏液換為0.65%NaCl溶液，心收縮力減弱；加3% CaCl2溶液，心臟收縮率有所增強，但舒張不完全；加1%KCl溶液，心收縮力減弱(圖1)。牛蛙和蟾蜍的離體心臟的收縮受上述離子的影響相似。

圖1 NaCl、CaCl2和KCl對離體心臟活動的影響

2.1.2藥物對心臟收縮的影響:濃度為0.001%的NA溶液兩滴使心臟收縮增強，舒張完全，出現幅度明顯增大心博曲線； 濃度為0.001%的Ach溶液兩滴使心臟收縮減弱，心率減慢，心臟停止舒張階段(圖2)。牛蛙及蟾蜍的離體心臟收縮受同種實驗用藥物影響相似。

圖2 NA和Ach對離體心臟的影響

2.1.3酸、堿對心臟收縮的影響:濃度為3%的LA兩滴，心臟收縮力明顯下降，短時間內基本停止跳動，立即滴加2.5% NaHCO3中和LA，心臟恢復節律性跳動(圖3)。

圖3 LA和NaHCO3對離體心臟活動的影響

由以上三張圖可知，在蛙心灌流實驗中，牛蛙與蟾蜍在Na+、Ca2+、K+，NA、Ach、LA和NaHCO3作用下對離體心臟活動的影響變化整體趨勢一致，無顯著性差異。

2.2 坐骨神經-腓腸肌實驗結果

2.2.1刺激牛蛙與蟾蜍分離出的坐骨神經-腓腸肌，記錄刺激強度與反應的關系，實驗結果見圖4。肌肉收縮最小時的刺激強度是0.1 V，0.15 V左右的刺激強度肌肉收縮幅度達到最大值且保持不變，兩組間無顯著性差異。

圖4 刺激強度與反應的關系

2.2.2坐骨神經-腓腸肌標本刺激頻率與反應的關系，如圖5所示。牛蛙及蟾蜍分別給與不同頻率的刺激，1.0 Hz肌肉單收縮，收縮幅度很小；6.0 Hz肌肉不完全強直收縮，幅度有所增強；頻率>20.0 Hz肌肉開始強直收縮，幅度大且幅度增強。以上結果表明，三種收縮力量為強直收縮>不完全強直收縮>單收縮。

圖5 刺激頻率與反應的關系

2.3 神經干動作電位傳導速度

結果見圖6，傳導速度v=(s2-s1)/(t2-t1)。牛蛙v=(3.5-2.7)cm/(6.32-5.84)ms=16.6 m/s；蟾蜍v=(4.5-2.5)cm/(18.80-17.28)ms=13.16 m/s。以上結果表明，牛蛙和蟾蜍的神經受到刺激后，神經干動作電位傳導速度大致相同。

綜合上述實驗結果，用牛蛙開展生理教學的蛙心灌流實驗，坐骨神經-腓腸肌相關實驗中牛蛙與蟾蜍的實驗結果趨于一致。

3 討論

本研究對比牛蛙與蟾蜍在蛙心灌流實驗結果得到坐骨神經-腓腸肌實驗結果驅于一致，表明可以利用牛蛙替代蟾蜍進行生理學教學實驗。

另外，牛蛙屬于經濟動物，供應途徑和動物質量可以得到有效的保證。牛蛙表面光滑，且沒有毒液，可以消除學生對蟾蜍的外觀和毒液有顧忌和抵觸心理和情緒。采用可養殖的經濟動物替代野生動物開展教學實驗，不僅提高實驗教學結果的可控性，也提高學生的法律意識，是現階段課程思政的重要組成部分[13-14]。

牛蛙為人工養殖，也存在一定局限性。本研究采用的牛蛙和蟾蜍比較，日齡較短未達到個體成熟，導致肌纖維、血管彈性及性差；蟾蜍為野生動物和牛蛙比較，日齡長，肌纖維及血管彈性和韌性都好，在蛙心灌流實驗中蟾蜍成功率大于牛蛙。

牛蛙因其生長較快，體型較大、四肢較蟾蜍發達及體表濕滑，因此在手持固定時比較困難，而且毀髓針在扎入牛蛙的枕骨打孔時，易扎傷。因此在實驗過程中，要小心操作，避免受傷。另外，在操作中也發現，牛蛙的后肢中伴隨著神經干的血管相對于蟾蜍較難剝離，需要在剝離過程中熟練操作。

牛蛙替代蟾蜍用于生理學教學實驗，符合實驗動物“3R”(替代、減少、優化)原則，有利于生理學實驗教學在符合國家法律法規下規范開展實驗教學工作。