兩種國產與一種進口小鼠肝炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒的比較研究

方 姣 梁錦寧 方 茜 朱康立 黃海娜 羅秋琳 潘炫孝 郭曉萍

(廣西醫科大學，南寧 530021)

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)屬于冠狀病毒科，是一種高度傳染性疾病[1]。MHV是《實驗動物微生物學等級及監測》(GB 14922.2—2011)國家標準規定的必檢項目，是我國清潔級或以上級別實驗小鼠應排除的病原之一。目前，病毒性病原體的檢測方法多采取血清學方法。國家標準《實驗動物 小鼠肝炎病毒檢測方法》(GB/T14926.22—2001)規定的檢測方法有酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、間接免疫熒光抗體實驗(IFA)和免疫酶實驗(IEA)。根據張志妮等[2]報道，對于日常大量樣本的MHV快速檢測，目前國內檢測單位一般采用ELISA初篩，陽性樣本用IFA進行復檢[2]。因此，選擇合適的ELISA檢測試劑盒尤為關鍵。檢測用試劑盒的標準化對檢測質量有極大的影響，并對檢測結果的準確起著決定性作用。檢測方法、技術規范和標準化保證研究成果的可靠性和科學性。歐美等國家已研制出了系列化和商品化的高質量檢測試劑盒，但是國內檢測試劑提供單位集中在2～3家，且側重不同的方法，可選擇性較小[3]。我校實驗動物中心目前使用的ELISA試劑盒為美國進口，價格昂貴且貨期長，因此不能滿足突發情況下的緊急需求。本研究擬對國內兩種MHV抗體ELISA試劑盒和國外一種同類試劑盒的靈敏度、特異性、精密性和可信度進行比較，篩選出既經濟又可靠且適合我校實驗動物中心的檢測試劑盒，以提高檢測結果的準確度和可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

A和B兩種國產MHV抗體ELISA檢測試劑盒；進口MHV ELISA抗體檢測試劑盒購自美國EBI-Xpress Biotech International；2019年國內送檢結果為陰性的10份陰性血清和10份陽性血清來源于本實驗室。

1.2 主要儀器

酶標儀(Thermo Fisher Scientific，型號：Multiskan GO)；移液槍(Eppendorf，型號：Eppendorf Research Plus)；離心機(Beckman coulter，型號：Allegra 30R)；37 ℃培養箱(上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHG-9070)。

1.3 方法

1.3.1實驗操作及判斷標準的確定

分別根據試劑盒說明書進行實驗以確定判斷標準。

①國產MHV抗體ELISA檢測A試劑盒(以下簡稱國產A)：在陰性和陽性對照(陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照孔平均值≤0.20)成立的情況下，臨界值=陰性對照孔(平均值+0.15)；待檢血清特異抗原孔A值<臨界值時，判為陰性；待檢血清特異抗原孔A值≥臨界值時，判為陽性；②國產MHV抗體ELISA檢測B試劑盒(以下簡稱國產B)：在陰性、陽性對照(陽性對照的陽性孔與陰性孔的差值≥0.6，陰性對照的陽性孔與陰性孔的差值≤0.25)成立的情況下，待檢血清陽性孔與陰性孔的差值<0.3時，判為陰性；待檢血清陽性孔與陰性孔的差值≥0.3，判為陽性；③進口MHV抗體ELISA檢測試劑盒(以下簡稱進口)，在陰性、陽性對照(陽性對照的陽性孔與陰性孔的差值≥0.6，陰性對照的陽性孔與陰性孔的差值≤0.25)成立的情況下：待檢血清陽性孔與陰性孔的差值<0.3，判為陰性；待檢血清陽性孔與陰性孔的差值≥0.3，判為陽性。

1.3.2敏感性實驗：根據王吉等[4]報道，MHV陽性血清從1∶50依次倍比稀釋到1∶12 800，樣品設置兩個重復，同時設置陰性對照和空白對照，按照以上三種試劑盒各自的判斷標準，最大稀釋比例的陽性孔為其檢測靈敏度。

1.3.3特異性實驗：三種試劑盒分別檢測試劑盒內的陽性對照，即：MHV、小鼠仙臺病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠細小病毒(MVM)、小鼠鼠痘病毒(MPV)及小鼠呼腸孤Ⅲ型病毒(Reo-3)。設置陰性和陽性對照，在陰性和陽性對照均成立的情況下，觀察每種試劑盒與除MHV外的5種病毒有無交叉反應。

1.3.4精密性實驗：同一批次試劑盒，對同一份陽性血清在同一稀釋度下同時檢測20孔，計算檢測結果的批內變異系數。

1.3.5可信度實驗：檢測上述10份陽性血清和10份陰性血清，驗證國產A、國產B和進口三種試劑盒的可信度。

1.3.6統計方法：對所得實驗數據用SPSS 20.0統計軟件進行秩和檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 敏感性實驗

國產和進口試劑盒對試劑盒陽性對照血清檢測，從表1檢測結果得出，國產B和進口試劑盒檢測靈敏度均較高，差異顯著(P<0.05)，且進口試劑盒是國產試劑盒B的4倍。

表1 敏感性實驗檢測結果

2.2 特異性實驗

每種試劑盒分別檢測各自攜帶的陽性對照，即：除MHV外的SV、PVM、MVM、MPV及Reo-3病毒陽性血清。實驗結果顯示，國產A檢測上述病毒陽性血清皆為陽性，說明該試劑盒與此5種病毒陽性血清存在交叉反應；國產B和進口試劑盒特異性實驗結果均為陰性，說明兩種試劑盒與此5種病毒均無交叉反應。

2.3 精密性實驗

三種試劑盒精密性實驗結果，見表2。國產A的批內變異系數為13.825%，國產B的批內變異系數為13.827%，進口的批內變異系數為5.667%。

表2 精密性實驗結果

2.4 可信度實驗

國產A中10個陽性血清中有6個陽性樣品未被檢出，其檢測符合率為40%，而10個陰性樣品有兩個檢出為陽性，檢測符合率為80%。國產B和進口試劑盒對10個陽性樣品均檢出了陽性，對10個陰性樣品均檢出了陰性，檢測符合率均為100%，結果如表3。

表3 ELISA檢測已知MHV抗體陰性及陽性血清結果

3 討論

MHV具有極高傳染性。根據仇保豐等[5]報道，當感染小鼠群免疫功能下降時，即可能引起整個鼠群爆發性的急性感染，導致動物大量死亡，嚴重影響實驗動物的生產和相關動物實驗結果。因此，定期檢測MHV，及時淘汰感染動物，可以避免不必要的經濟損失。在實際應用中，通常采用ELISA初篩，針對初篩中的可疑樣本，進一步用其他檢測方法進行驗證，確定其準確結果。

檢測進口陽性對照血清靈敏度實驗顯示：國產A和國產B分別為1∶1和1∶400，進口為1∶1 600，說明國產A靈敏度很低，國產B與進口檢測進口陽性血清靈敏度均較高(均達到1∶400以上)，進口試劑盒陽性血清靈敏度比國產B高4倍。特異性實驗顯示：國產A對SV、MPV、PVM、MVM及Reo-3皆檢出為陽性，說明此類試劑盒的特異性差；國產B和進口試劑盒對上述5種陽性血清皆檢出陰性，表明進口的試劑盒特異性良好。精密性實驗顯示：國產A的批內變異系數為13.825%，國產B的批內變異系數為13.827%，兩種國產試劑盒批內變異系數均大于10%，說明國產A和國產B的精密性較差。進口試劑盒批內變異系數為5.667%小于10%，說明進口試劑盒精密性良好。三者精密性的優劣順序依次為：進口、國產A及國產B。可信度實驗顯示：國產A試劑盒陽性檢測符合率為40%，陰性檢測符合率為80%。國產B和進口試劑盒陰性和陽性檢測符合率均為100%，說明國產A試劑盒的可信度低，國產B和進口試劑盒的可信度高。

通過以上研究得到三種試劑盒在靈敏性、特異性、精密度和可信度方面的優點和缺陷，最終篩選到國產B試劑盒既經濟又可靠且適合我校動物中心使用的經濟實惠的國產MHV抗體檢測試劑盒。