不同濃度鹽脅迫對桑樹光合系統的影響1)

張倍寧 高世醒 車延輝 孫廣玉

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

鹽堿地是指土壤里面含有的鹽分影響到作物正常生長的土地，當前根據聯合國教科文組織和糧農組織不完全統計，全世界鹽堿地面積為9.543 8億hm2，其中我國約為9 913萬hm2[1]。在嚴重的鹽堿土壤地區許多植物幾乎不能生存，寶貴的土地資源被浪費，使得生態經濟與產業發展都面臨著巨大挑戰與威脅。深入研究植物耐鹽機制，高效利用鹽堿地，使鹽堿地對于我國經濟持續健康發展、國土治理、生態環境保護等具有極其重要的現實意義。

有研究表明，鹽脅迫會誘發植物體內多種結構和功能的改變，抑制植物的光合作用[2]，且鹽濃度越高、時間越長，抑制作用越明顯[3-5]。迄今為止，有許多學者報道了對于不同植物通過光合作用調節植物鹽代謝的機理，研究發現，鹽脅迫可以抑制高粱幼苗光合系統Ⅱ(PSⅡ)原初光能轉換效率和 光合系統Ⅱ潛在活性，增加光合系統Ⅱ非輻射能量的耗散[6]。而麻瘋樹幼苗會通過增強類囊體膜等細胞膜的穩定和膜功能等，從而促進細胞光合等生理生化代謝[7]。桑樹作為重要耐鹽植物，已有研究發現，鹽脅迫時Na+的積累會減少對K+、Ca2+、Mg2+的吸收，抑制這些離子的生理功能；桑樹在長期鹽脅迫時，還會導致水勢下降，而形成水分脅迫，限制了水分進入細胞[8]；外界CO2濃度的變化，也會影響桑樹幼苗的凈光合速率[9]。環式電子傳遞在植物逆境脅迫中發揮重要的作用，有研究表明，環式電子傳遞在提高桑樹的抗旱性方面發揮重要作用[10]。但目前關于不同鹽濃度對桑樹葉片光系統的損傷位點、環式電子流對不同鹽濃度時桑樹光合系統Ⅱ的保護機制，還沒有得到共識。

本研究以黑龍江省蠶業研究所提供的1年生‘秋雨桑’(MorusalbaL.)實生苗為試驗材料，在東北林業大學植物生理實驗室分別用濃度為100、150、200 mmol/L的鹽溶液處理桑樹枝條，以蒸餾水作為對照處理；應用脈沖調制熒光儀(FMS-2)和多功能植物效率分析儀(M-PEA)聯合的方法，測定葉片還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脫氫酶復合物依賴型的環式電子傳遞、質子梯度調節(PGR5)依賴型的環式電子傳遞、快速葉綠素熒光動力學曲線、葉綠素熒光和光合系統Ⅱ反應中心吸收光能分配參數；采用單因素方差分析、最小顯著差異法比較不同數據組間的差異，分析不同濃度鹽脅迫處理對桑樹葉片光系統的損傷位點。旨在為桑樹光系統抵御鹽脅迫及鹽脅迫地區其他樹種的栽植提供參考。

1 材料與方法

以黑龍江省蠶業研究所提供的1年生‘秋雨桑’實生苗為試驗材料，于2020年2—12月份在東北林業大學植物生理實驗室進行試驗。將幼苗移栽到高17 cm、直徑15 cm的由土與蛭石(V(草炭土)∶V(蛭石)=2∶1)混合均勻的盆缽中，待植株長到40 cm時，挑選長勢一致的桑樹，選取統一位置剪下枝條，進行預處理。

分別用濃度為100、150、200 mmol/L的鹽溶液處理桑樹枝條，以蒸餾水作為對照處理(CK)；將其放進光照培養箱中，黑暗14 h、光照8 h，觀察枝條狀態，并測定有關指標。每個處理都進行5個平行試驗，處理桑樹枝條4 d后測定各項指標。

葉片還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脫氫酶復合物介導的環式電子流的測定：FMS-2脈沖調制熒光儀(Hansatech，英國)測量葉綠素熒光信號[11]，本研究將葉片暗適應處理30 min后，用作用光(54 μmol·m-2·s-1)誘導照射葉片300 s后關閉作用光；由于依賴NDH的環式電子流(CEF)的存在，關閉作用光后葉綠素熒光升高，用最低點和最高點的落差定性表示依賴NDH的環式電子流的大小。

葉片質子梯度調節(PGR5)介導的環式電子流的測定：利用多功能植物效率分析儀(M-PEA，Hansatech，英國)測定光合系統Ⅰ反應中心色素分子(P700)氧化還原動力學[10]，本研究將葉片30 min暗適應后，給予60 s 20%的弱遠紅光，再關閉弱遠紅光60 s，目的是使P700氧化后再在暗中被還原。之后，利用有效補充光(5 mmol·m-2·s-1)得到P700的回升最大值。給予弱遠紅光時P700會大幅降低，之后關閉遠紅光，因為環式電子流的存在P700會有所回升，用之間的落差表示PGR5介導的環式電子流。

葉片快速葉綠素熒光動力學曲線的測定：使用多功能植物效率分析儀(M-PEA)測定葉片暗適應30 min后的葉綠素熒光動力學曲線和820 nm光學反射曲線(MR820)[12]。本研究將在測定快速葉綠素熒光誘導動力學(OJIP)曲線時，誘導光強為3 500 μmol·m-2·s-1的紅光脈沖。曲線上O、J、I、P點分別對應的時間為0.02、2.00、30.00、1 000.00 ms，將OJIP曲線標準化后，根據公式(Ft-Fo)/(Fm-Fo)分析各點的相對熒光強度，式中：Ft為各時間點的相對熒光強度，Fo為初始熒光強度，Fm為最大熒光強度。將O-K、O-J、O-P曲線標準化，即可分別得到相對可變熒光VO-K、VO-J、VO-P的時間對應曲線，便可分別分析J點(2.00 ms)、I點(30.00 ms)的相對可變熒光VJ、VI變化。光合系統Ⅰ(PSⅠ)反應中心用820 nm處最大吸光度(Im)與最小吸光度(Io)之差的相對值表示，ΔI/Io=(Im-Io)/Im。

葉片葉綠素熒光和光系統Ⅱ反應中心吸收光能分配參數的測定[13]：葉片30 min暗適應后，使用FMS-2脈沖調制熒光儀，測定初始熒光強度(Fo)、最大熒光強度(Fm)、光系統Ⅱ最大光化學效率(FV/Fm，FV為可變熒光強度)、光化學淬滅系數(Qp)、非光化學淬滅系數(QNP)、電子傳遞速率(RET)，過剩光能用(1-Qp)/QNP計算。

數據處理：運用 Excel(2016)、SPSS(23.0)軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析、最小顯著差異法比較不同數據組間的差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鹽脅迫對桑樹葉片環式電子流的影響

對桑樹葉片分別進行不同濃度(100、150、200 mmol/L)的鹽脅迫處理后，測得PGR5依賴型環式電子流的相關數據(見圖1A、表1)，定量化處理后分析得出，不同處理的桑樹葉片PGR5依賴型環式電子流都高于CK，其中濃度為150 mmol/L的鹽脅迫處理最為顯著。濃度為100、150、200 mmol/L的NaCl脅迫處理的葉片，PGR5依賴型環式電子流分別比CK高4.07%(P>0.05)、24.39%(P<0.05)、6.07%(P>0.05)。濃度為150 mmol/L的NaCl脅迫處理的葉片，PGR5依賴型環式電子流分別比濃度為100、200 mmol/L的NaCl脅迫處理的葉片高16.34%(P<0.05)、14.73%(P<0.05)。

表1 不同濃度鹽脅迫時葉片的PGR5依賴型環式電子流

關閉作用光后，由于NDH依賴型環式電子流的存在，熒光曲線會上升(見圖1B)，4種處理時的NDH介導的環式電子流都顯著升高，濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的NDH依賴型環式電子流曲線均低于CK處理的。CK處理時的曲線在顯著升高后開始緩慢下降，而不同濃度鹽脅迫時的環式電子流曲線均繼續緩慢升高。其中，濃度為100、150 mmol/L鹽脅迫處理時的環式電子流曲線，分別在關閉作用光450、550 ms后開始超過CK的環式電子流曲線；而濃度為200 mmol/L的NaCl脅迫處理的NDH依賴型環式電子流一直處于較低狀態。

圖1 不同濃度鹽脅迫時葉片的PGR5和NDH依賴型環式電子流

2.2 不同濃度鹽脅迫對桑樹葉片光合系統Ⅰ活性的影響

由圖2可見：在遠紅光照明過程中，820 nm光信號的相對下降反映了光合系統Ⅰ的活性(ΔI/Io)。與對照相比，不同濃度鹽脅迫處理的葉片ΔI/Io都呈下降趨勢，并且隨著鹽濃度的增高，ΔI/Io逐漸降低(見表2)。濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理時的ΔI/Io，分別比CK低10.22%(P>0.05)、18.68%(P<0.05)、29.80%(P<0.05)；濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理時ΔI/Io，分別比濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理時高9.42%(P>0.05)、21.81%(P<0.05)；濃度為150 mmol/L的鹽脅迫處理時的ΔI/Io，比濃度為200 mmol/L的鹽脅迫處理時的高13.67%(P<0.05)。

圖2 不同濃度鹽脅迫時葉片的MR820曲線

表2 不同濃度鹽脅迫時葉片的ΔI/Io

2.3 不同濃度鹽脅迫對桑樹葉片葉綠素熒光參數的影響

由圖3A可見，VO-K曲線在不同濃度鹽處理時沒有顯著差異，將VO-K曲線標準化處理后得到ΔVO-K曲線(見圖3B)。與CK相比，不同濃度鹽脅迫處理的葉片ΔVO-K曲線呈先上升后下降的趨勢，其中濃度為150、200 mmol/L的鹽處理，ΔVO-K曲線在0.15 ms左右達到最大值；將VO-J曲線(見圖3C)標準化處理后得到ΔVO-J曲線(見圖3D)，濃度為150、200 mmol/L的鹽處理，ΔVO-J曲線隨時間的增加，先顯著上升，在0.3 ms左右達到峰值后下降。濃度為100 mmol/L的鹽處理，ΔVO-J曲線由開始便迅速下降到最低點，然后再緩慢上升，但數值一直為小于零。

圖3 不同濃度鹽脅迫處理的葉片葉綠素熒光參數

在OJIP曲線上通過標準化點J獲得相對熒光強度(見表3)，在不同的鹽濃度脅迫時相對熒光強度(VJ)均高于CK處理，濃度為100、150、200 mmol/L的鹽處理的VJ，分別比CK高7.07%(P>0.05)、35.00%(P<0.05)、12.25%(P>0.05)；濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理的VJ，分別比濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的低26.09%(P<0.05)、4.84%(P<0.05)。在OJIP曲線上通過標準化點I獲得相對熒光強度(見表3)，不同鹽濃度脅迫時的相對熒光強度(VI)均高于CK處理，濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的VI，分別比CK高4.91%(P>0.05)、9.06%(P<0.05)、1.95%(P>0.05)。

表3 不同濃度鹽脅迫時葉片的VJ、VI

2.4 不同濃度鹽脅迫對桑樹葉片光合系統Ⅱ電子傳遞鏈和活性的影響

與對照相比，不同鹽脅迫處理時，葉片的電子傳遞速率(RET)有一定降低(見表4)；濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理時葉片的電子傳遞速率降低不顯著，濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理時葉片的電子傳遞速率較CK的顯著降低。濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片的電子傳遞速率，分別比CK低3.87%(P>0.05)、45.42%(P<0.05)、32.28%(P<0.05)。

與葉片的電子傳遞速率相似，不同鹽脅迫處理時，葉片光合系統Ⅱ實際光化學效率(YⅡ)也都有一定降低(見表4)。濃度為150 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片PSII實際光化學效率顯著降低；濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光合系統Ⅱ實際光化學效率，分別比CK低27.80%(P<0.05)、19.34%(P>0.05)；濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光合系統Ⅱ實際光化學效率，與CK差異不顯著。

表4 不同濃度鹽脅迫時葉片的電子傳遞速率(RET)和光合系統Ⅱ實際光化學效率(YⅡ)

2.5 不同濃度鹽脅迫對桑樹葉片熱耗散及過剩光能的影響

由表5可見：濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光化學淬滅系數(Qp)，與對照相比有所增加；濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光化學淬滅系數，與CK相比較低；濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光化學淬滅系數比濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光化學淬滅系數，分別高24.43%(P>0.05)、23.94%(P<0.05)。與對照相比，濃度為200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片非光化學淬滅系數(QNP)顯著下降；濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片非光化學淬滅系數，比CK高3.76%(P>0.05)，比濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的分別高25.83%(P<0.05)、34.32%(P<0.05)。隨著鹽濃度的逐漸增加，葉片過剩光能也逐漸增高；濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片的過剩光能，分別比CK高13.18%(P>0.05)、83.13%(P<0.05)、131.76%(P<0.05)。

表5 不同濃度鹽脅迫時葉片的光化學淬滅系數、非光化學淬滅系數及過剩光能

2.6 不同濃度鹽脅迫對桑樹葉片最大光化學效率及光合性能指數的影響

由表6可見：不同濃度鹽脅迫處理時的葉片光合性能指數(IP,abs)，均比對照處理顯著降低。濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光合性能指數，分別比CK低48.61%(P<0.05)、69.36%(P<0.05)、51.30%(P<0.05)；濃度為150 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片光合性能指數，分別比濃度為100、200 mmol/L的鹽脅迫處理的低67.76%(P<0.05)、58.98%(P>0.05)。與對照組相比，濃度為150 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片的總光合性能指數(IP,t)顯著下降，較CK低40.36%(P<0.05)；濃度為100、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片總光合性能指數，較CK差異不顯著。在葉片暗適應30 min后測得最大光化學效率，不同鹽脅迫處理的葉片最大光化學效率都比對照有所降低；濃度為100、150、200 mmol/L的鹽脅迫處理的葉片最大光化學效率，分別比CK低4.54%(P>0.05)、6.91%(P>0.05)、10.36%(P<0.05)。

表6 不同濃度鹽脅迫時桑樹葉片最大光化學效率、光化學性能指數及總光合性能指數

3 討論

有研究表明，PGR5依賴的環式電子流可以保護光合系統Ⅱ反應中心，減少對光色素的應力損傷[14]。本研究中，桑樹葉片經過不同濃度鹽脅迫處理后，PGR5依賴型環式電子流都高于CK，其中濃度為150 mmol/L的鹽脅迫處理最為顯著(見圖1A、表1)， 說明鹽脅迫提高了PGR5介導的環式電子流的傳遞速率和傳遞能力，從而提高保護光合系統Ⅱ反應中心的能力，利于減少光色素的應力損傷，濃度為150 mmol/L的鹽脅迫時傳遞效率最高。葉片暗適應處理30 min后，用作用光(54 μmol·m-2·s-1)誘導照射葉片300 s后關閉作用光，由于存在NDH依賴型環式電子流，導致關閉作用光后葉綠素熒光瞬間上升，所以可以通過觀察葉綠素熒光瞬間上升是否缺失，判定NDH依賴型環式電子流的活性[15]。不同濃度鹽脅迫處理的葉片NDH依賴型環式電子流，與CK相比顯著降低(圖1B)，說明鹽脅迫抑制了NDH復合體介導的環式電子流的傳遞。

820 nm光學反射曲線(MR820)在不同處理時的數據用ΔI/Io表示，ΔI/Io反應了光合系統Ⅰ反應中心的活性[12]，其中濃度為200 mmol/L的鹽脅迫時與CK相比顯著降低(見圖2、表2)，說明鹽濃度越高對光合系統Ⅰ反應中心損害越大，進而影響了光合作用。

葉片的電子傳遞速率代表了線性電子傳遞速率，可以用來衡量光合電子傳遞能力[20]。光合系統Ⅱ實際光化學效率代表光合系統Ⅱ的光化學產量[21]。與對照相比，不同鹽脅迫處理時，葉片的電子傳遞速率(RET)有一定降低。其中濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理時降低不顯著，濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理時葉片的電子傳遞速率降低較顯著(見表4)。說明鹽脅迫降低了表觀光合電子傳遞速率。鹽脅迫對光系統Ⅱ實際光化學效率也有一定的影響，其中中度鹽脅迫處理時的光系統Ⅱ實際光化學效率降低最為顯著(見表4)，這正是因為中度鹽脅迫阻礙了光合系統Ⅱ的QA到QB的電子傳遞所致。

光化學淬滅系數(Qp)代表光適應下光合系統Ⅱ進行光化學反應的能力，即開放的光合系統Ⅱ反應中心的程度[22]。濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理時的光化學淬滅系數與CK 處理相比顯著增加，濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理時的光化學淬滅系數與CK相比有所降低(見表5)。說明一定的鹽脅迫可以增加光合系統Ⅱ反應中心的開放程度，但是鹽濃度過大反而會抑制光合系統Ⅱ反應中心的開放。非光化學淬滅系數代表非光化學淬滅，通過非光化學淬滅系數的調節使得光化學淬滅系數保持恒定，確保電子傳遞速率與CO2固定速率一致[23]。濃度為100 mmol/L的鹽脅迫處理時的非光化學淬滅系數與CK 處理相比稍有增加，濃度為150、200 mmol/L的鹽脅迫處理時的非光化學淬滅系數與CK相比有所降低(見表5)；說明一定的鹽脅迫可以增加非光化學淬滅系數的調節能力，促進光化學淬滅系數保持恒定，耗散由于鹽脅迫導致的過剩光能；但是，鹽濃度過大，反而會擾亂非光化學淬滅系數的調節能力，使得光化學淬滅系數無法保持恒定。有研究表明，隨著鹽濃度的升高，過剩光能增加[24]。本研究表明，輕度鹽脅迫處理，光合系統Ⅱ的過剩光能與CK沒有差異(見表5)；結合非光化學淬滅系數指標說明，輕度鹽脅迫的葉片可以通過調節非光化學淬滅系數耗散多余的熱量，從而保護光系統。中度鹽脅迫的過剩光能明顯增加(見表5)，非光化學淬滅系數卻降低(見表5)，但是PGR5環式電子傳遞增強(見表1)，說明中度鹽脅迫處理激發了PGR5依賴型環式電子傳遞，將能量用于電子傳遞，而不是熱耗散。重度鹽脅迫，過剩光能增多(見表5)、非光化學淬滅系數降低(見表5)、NDH依賴型環式電子傳遞和PGR5依賴型環式電子傳遞均沒有顯著增加(見圖1)、光合系統Ⅰ活性受損(見表2)，說明重度鹽脅迫嚴重破壞了光合機構。

光化學性能指數代表以光吸收為基礎的光合性能指標，是研究植物光合生理狀態的重要參數。總光合性能指數代表了總光合性能指數。最大光化學效率反應桑樹葉片光合作用光合系統Ⅱ反應中心光能轉化效率，常用最大光化學效率下降程度反映光抑制程度的大小[20]。在正常條件下，該參數變化較小，不受物種和生長條件的影響，逆境下該參數明顯下降。在本研究中，不同鹽濃度時的光化學性能指數均與CK處理相比有所降低，但總光合性能指數與CK處理沒有顯著差異，只有重度鹽脅迫處理時，最大光化學效率比CK明顯下降(見表6)，說明一定的鹽脅迫對植物光合機構不會造成不可逆的損傷，而重度鹽脅迫對光合性能造成嚴重傷害，降低了桑樹葉片光合系統Ⅱ反應中心的活性。

綜上所述，不同濃度鹽脅迫對光合機構的損傷位點不同(見圖4)。

圖中不同顏色方塊代表不同濃度鹽脅迫的最重損傷位點。紫色為輕度鹽脅迫(100 mmol/L)，黃色為中度鹽脅迫(150 mmol/L)，紅色為重度鹽脅迫(200 mmol/L)。

4 結論

鹽脅迫會導致桑樹光合機構受到影響。輕度鹽脅迫會激發熱耗散，耗散多余的熱量；中度鹽脅迫會激發PGR5依賴型環式電子傳遞，將光合系統Ⅰ過剩的電子重新循環，保護光合系統Ⅰ；重度鹽脅迫時，光合系統Ⅱ和光合系統Ⅰ都受到嚴重損傷，這種損傷是不可逆的。