17β-雌二醇對人成骨肉瘤細胞CLCF1 基因表達的影響

（福建省中醫藥科學院基礎研究室，福建 福州 350003）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是一種與衰老有關的常見病，主要發生在絕經后婦女，是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，導致骨脆性增加，易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病。研究顯示，絕經后骨質疏松癥以腎陰虛為主[1，2]。前期研究發現[1]，CLCF1 是PMOP 腎陰虛證的關聯基因，CLCF1 在PMOP 腎陰虛證組的表達水平明顯低于健康對照組，但其失調的原因尚未可知。女性絕經后雌激素水平下降，骨偶聯過程失調，這是PMOP 發生的主要原因[3]。雌激素在維持骨代謝動態平衡方面扮演著非常重要的角色，PMOP 腎陰虛證患者雌激素水平對CLCF1 基因表達是否有影響，目前尚未見報道。因此本研究通過體外觀察17β-雌二醇對MG-63 細胞CLCF1 表達的影響，旨在揭示CLCF1 基因在PMOP 腎陰虛證的表達調控機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 本實驗于2019 年4 月～2020 年8月在福建省中醫藥科學院完成。人骨肉瘤細胞MG-63 購自中國科學院上海細胞庫，主要試劑包括無酚紅a-MEM 培養基（Thermo fisher 公司）、胰酶（Hyclone 公司）、胎牛血清FBS、牛血清白蛋白BSA（Sigma 公司）、17β-雌二醇（MCE）、雌激素受體抑制劑氟維司群（MCE 公司）、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega 公司）。主要儀器涉及酶標儀（Tecan 公司，Infinite M1000），實時熒光定量PCR 儀（ABI 公司，7500 FAST）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 復蘇凍存的MG-63 細胞，培養液為10%的無酚紅a-MEM 培養基，按105 細胞量接種于6 孔板中，于37℃，5%CO2條件下培養。24 h 后改用0.1% BSA 的無血清培養3 h 使細胞同步化。

1.2.2 干預實驗 將骨肉瘤細胞MG-63 分為對照組、β-雌二醇低、中、高劑量組。對照組加入10-3mol/L DMSO，將17β-雌二醇用DMSO 稀釋后，分別加入β-雌二醇低、中、高劑量組，終濃度分別為10-10、10-9、10-8mol/L。干預24、48、72 h 分別后消化細胞，采用ABI 7500 Real time PCR 檢測樣本中mRNA 的表達情況。用2-△△Ct法分析基因的表達情況。

1.2.3 構建載體及轉染 PCR 擴增目的基因CLCF1，酶切pGL3-basic 質粒后，回收載體片段。將目的基因與載體片段同源重組后，轉化大腸桿菌感受態細胞。用菌落PCR 鑒定轉化子，篩選出陽性克隆，送測序。測序無誤的克隆進行質粒抽提。將MG63 細胞接種到6 孔板，12 h 后轉染。分別加入10-3mol/L DMSO，10-8mol/L 17β，10-8mol/L 17β-雌二醇+10-7mol/L 雌激素受體抑制劑ICI。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測 轉染24 h 后，棄去培養基，用PBS 清洗后，每孔加入300 μl 的PLB 細胞裂解液，室溫振搖15 min 使之裂解。在96 孔板中每孔加20 μl 預先混好的Luciferase Assay ReagentⅡ，再加入細胞裂解液上清30 μl，2 s 后測數據。之后立即加入20 μl 終止反應試劑，靜止2 s 后，用酶標儀進行熒光素酶活性檢測。

1.3 統計學分析 數據采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，當方差齊時，選用LSD-t 檢驗，當方差不齊時，選用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CLCF1 基因表達比較 熒光定量PCR 顯示，干預24 h 后，β-雌二醇低、中、高劑量組CLCF1的表達分別是對照組的8.21 倍、9.67 倍、10.07 倍，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。干預48 h 后，β-雌二醇低、中、高劑量組CLCF1 的表達分別是對照組的0.93 倍、1.26 倍、2.1 倍，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2；干預72 h 后，β-雌二醇低、中、高劑量組CLCF1 的表達分別是對照組的0.48 倍、0.95倍、1.38 倍，見圖3，其中β-雌二醇低劑量組與對照組比較，表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05），β-雌二醇中、高劑量組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

圖1 干預24 h 各組CLCF1 基因表達比較

圖2 干預48 h 各組CLCF1 基因表達比較

圖3 干預72 h 各組CLCF1 基因表達比較

表1 各組CLCF1 基因表達比較（）

表1 各組CLCF1 基因表達比較（）

2.2 轉染后熒光素酶活性比較 與對照組相比，17β-雌二醇高劑量組熒光素酶活性提高，差異有統計學意義（P＜0.05）；加入雌激素受體抑制劑ICI 后，熒光素酶活性較對照組降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖4。

表2 轉染后熒光素酶活性（）

表2 轉染后熒光素酶活性（）

圖4 轉染后熒光素酶活性

3 討論

絕經后骨質疏松癥是老年常見多發病。女性絕經后卵巢功能衰退，雌激素水平下降，目前研究證實雌激素可通過多條信號通路影響骨骼的生長和重構，如MEK/ERK 信號通路[4]、NF-κB 信號通路[5]、FasL 信號通路[6]等，其作用機制復雜，且內在機理尚未完全闡明。前期研究發現CLCF1 是PMOP 腎陰虛證的關聯基因，PMOP 腎陰虛證組CLCF1 表達水平明顯降低。PMOP 腎陰虛證患者雌激素和CLCF1 水平同時降低，然而關于雌激素和CLCF1 之間的關系報道較少。

本研究顯示，分別用10-10、10-9、10-8mol/L 17β-雌二醇干預MG63 細胞24 h 后，CLCF1 的表達分別是對照組的8.21 倍、9.67 倍、10.07 倍，說明三個濃度均能促進CLCF1 的表達，且隨著濃度上升，CLCF1 表達呈劑量依賴性，以10-8mol/L 17β-雌二醇促進作用最明顯；干預48h 后，加入10-10、10-9、10-8mol/L 17β-雌二醇的MG63 細胞CLCF1 的表達分別是對照組的0.93 倍、1.26 倍、2.1 倍，其中10-8mol/L 17β-雌二醇可以促進CLCF1 基因的表達，但與24 h 相比，促進作用已經減弱；干預72 h后，低、中、高三個劑量組CLCF1 的表達分別是對照組的0.48 倍、0.95 倍、1.38 倍，其中β-雌二醇低劑量組與對照組比較，表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05），β-雌二醇中、高劑量組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），說明17β-雌二醇作用72 h后，對CLCF1 基因已經沒有促進作用，甚至出現了抑制作用。因此可以確定篩出最佳條件：10-8mol/L 17β-雌二醇作用MG63 細胞24 h，對CLCF1 基因表達的促進作用最高。本研究還顯示，10-8mol/L 17β-雌二醇組熒光素酶活性高于對照組，說明17β-雌二醇可以提高CLCF1 基因的啟動子活性；當17β-雌二醇加上雌激素受體抑制劑后，熒光素酶活性降低，推斷雌激素受體抑制劑與17β-雌二醇聯合作用可阻斷17β-雌二醇的作用，進一步驗證了17β-雌二醇可以提高CLCF1 基因的啟動子活性。

CLCF1 為重組心肌營養素樣細胞因子1 基因表達的蛋白，是糖蛋白（gp）130 因子家族成員之一，是一種強效神經營養因子、B 細胞刺激因子。它主要存在于淋巴結和脾臟。CLCF1 可通過gp130 受體刺激B 細胞活化，參與體液免疫，是人體免疫方面的重要基因[7，8]。課題組前期研究發現，CLCF1 可通過調控JAK2/STAT3 蛋白、磷酸化水平，達到調控骨代謝的目的[9]。JAK2/STAT3 信號通路廣泛參與細胞增殖、分化以及免疫調節等，是眾多細胞因子信號轉導的重要途徑，參與多種細胞因子對骨代謝的調節[10-12]。有研究[13，14]表明JAK2/STAT3 信號通路可能是細胞因子調控RANKL 誘導破骨細胞分化重要的分子途徑，雌激素可以激活JAK2/STAT3 信號通路。鑒于CLCF1 和雌激素都可以激活JAK2/STAT3 信號通路，本研究證實17β-雌二醇可以促進CLCF1 基因的表達，故推測17β-雌二醇可能通過CLCF1 激活JAK2/STAT3 通路，達到調控骨代謝的目的，這可能也是骨質疏松癥腎陰虛證的分子機制之一。但是17β-雌二醇如何調控CLCF1 基因的表達，進而調控絕經后骨質疏松癥腎陰虛證，還需要進一步證實。

綜上所述，17β-雌二醇可通過提高CLCF1 啟動子活性促進MG63 細胞株CLCF1 基因的表達，這可能是絕經后骨質疏松癥腎陰虛證的分子機制之一。