基于BSA重測序定位花生含油量相關基因位點

李玉穎，于海洋，呂玉英，楊會，張秀榮，張昆，劉風珍，萬勇善

（山東農業(yè)大學農學院/作物生物學國家重點實驗室/山東省作物生物學重點實驗室，山東 泰安 271018）

花生是全球范圍內重要的油料作物，目前國產花生總量的55%用于榨油［1］。植物油脂是人類飲食的重要成分，含有的多種脂肪酸是維持人體生長、發(fā)育和機體正常活動的必需脂肪酸。此外，植物油脂中含有的不飽和脂肪酸可降低血清膽固醇和甘油三酯，能有效防治心腦血管疾病。植物油脂也是重要的能源和工業(yè)原料，是生物燃料的原料［2］。所以提高籽仁含油量是花生育種的重要目標之一。

植物種子油脂是由脂肪酸和甘油合成的高級脂肪酸甘油酯［3］，以三酰甘油的形式儲存于種子中，在成熟種子中主要以油體的形式存在。在脂肪酸合成途徑中，乙酰CoA羧化酶（ACCase）催化的反應是脂肪酸生物合成的限速步驟，是控制碳流進入脂肪酸生物合成的重要調控位點［4］。脂肪酸合酶復合體中的酰基載體蛋白ACP也是脂肪酸合成中的重要蛋白［5，6］。脂肪酸和甘油一般通過Kennedy途徑［7］形成三酰甘油，主要涉及3個酰基轉移酶——磷酸甘油酰基轉移酶（glycerol-3-phosph ateacyl transferase，GPAT）［8-10］、溶血磷脂酸酰基轉移酶（lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）［11，12］、二酰甘油脂酰轉移酶（diacyl glycerol acyl transferase，DGAT）［13，14］。

植物油脂合成代謝受到轉錄因子的調控，比如LEC、WRI、DOF［15，16］等。另外，種子發(fā)育階段對油脂積累也有影響，種子發(fā)育早期油脂的積累比較緩慢，開花后21～39天是油脂含量增加最快的時期，種子成熟時油脂含量達到最大值［17］。唐兆秀等［18］發(fā)現(xiàn)花生莢果充實過程中，籽仁粗脂肪含量增長曲線呈拋物線型。同時，激素也可以調節(jié)油脂的積累。高濃度的ABA對于多數(shù)油脂合成途徑中的基因表達具有抑制作用［19］。NAA誘導對脂質合成積累表現(xiàn)出顯著的促進效應［20］。

綜上所述，植物油脂合成代謝是重要的生物學過程，受到許多因素的影響，遺傳機制復雜。利用QTL定位方法研究花生籽仁含油量并挖掘候選基因具有重要意義。近年來花生含油量相關QTL定位研究取得一定進展。郭建斌［21］在B03和A08染色體上檢測到與含油量相關的2個QTLs，貢獻率為9.76% ～22.00%。李新平等［22］在3個種植環(huán)境下檢測到15個與含油量相關的QTLs，分布在LG1、LG7、LG8、LG15、LG16、LG18、LG19共7個連鎖群上，貢獻率為4.64% ～16.24%。Yaduru等［23］在A02、A08、A10、B03、B06、B09染色體上，共獲得8個與含油量相關的QTLs，貢獻率為5.67% ～22.11%。王瑤［24］在4個種植環(huán)境下共檢測到10個含油量相關QTLs，分布在A02、A03、A04、A06、A07、B01、B02、B04染色體上，貢獻率為2.36% ～11.61%。以上是通過構建遺傳圖譜進行連鎖分析獲得的QTL位點，這種方法成本高、耗時長。BSA（bulked segregant analysis）又叫集團分離分析法，是用于基因快速定位的一類分析方法，其選擇群體中兩極端性狀個體構建混池，通過分析兩極端混池的差異獲得與性狀相關聯(lián)的分子標記。它不需要對所有個體進行分析，成本低、效率高，是目前基因定位的有效手段［25］。目前尚未見有利用BSA重測序對花生含油量相關基因定位的研究。本研究以本課題組選育的高油品系農大D666為父本，與普通含油量品種P12雜交，構建F2群體，利用BSA重測序方法分析定位與花生含油量相關的QTLs，為提高花生籽仁含油量及分子標記育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與性狀調查

2017年以普通含油量品種P12為母本、高油花生品系農大D666為父本進行雜交，構建了包括568個單株的F2群體。按單株進行收獲，莢果自然曬干。選取飽滿均一的籽仁20 g磨成粉末，取2 g粉末為一個重復，共3次重復。采用索氏提取法［26］測定花生籽仁含油量。

1.2 極端混池構建與測序

根據(jù)索氏提取法測定的花生籽仁含油量數(shù)據(jù)，選取F2群體中極端高油和低油單株各30個，以及兩個親本P12和農大D666，取其幼嫩葉片后用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。將30個高油單株和30個低油單株的DNA分別等量混合，構建高油和低油混池。對親本及兩個混池進行重測序，4個樣本分別將DNA進行機械打斷，對DNA片段進行修飾，再用瓊脂糖凝膠電泳選擇200～300 bp的片段，進行PCR擴增形成測序文庫，文庫質檢合格后用Illumina HiSeq平臺進行測序。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行過濾，主要步驟如下：（1）去除帶接頭（adapter）的reads；（2）過濾N含量超過10%的reads；（3）去除低質量reads（質量值低于10的堿基超過50%的reads）。另外，過濾掉同時比對到多條染色體上的reads。

利用bwa［27］軟件將過濾后的reads比對到花生參考基因組（參考基因組下載網址：https：//www.peanutbase.org/peanut_genome/）。比對結果使用Picard［28］的Mark Duplicate工具去除重復，使用GATK［29］軟件進行SNP和InDel變異檢測，對變異檢測結果進行嚴格過濾，利用ANNOVAR［30］對SNP和InDel變異檢測結果進行注釋。

1.3 花生籽仁含油量性狀的基因定位

篩選親本間純合差異的SNP位點，以高油親本農大D666作為突變型，分析計算兩個子代混池在親本間標記位點的SNP-index（即SNP的頻率）及 ΔSNP-index。計算方法如下：SNP-index（a/b）=Ma/b/（Ma/b+Pa/b），其中：Ma/b表示a/b池來源于突變性狀親本的深度，Pa/b表示a/b池來源于野生性狀親本的深度；ΔSNP-index=SNPindex（a）-SNPindex（b），其中：a代表突變性狀對應的混池，b代表野生性狀對應的混池。選擇1 Mb為窗口、1 kb為步長對ΔSNP-index在各個染色體上的分布進行平滑作圖，選取99%置信水平作為篩選的閾值，置信水平以上的窗口作為與含油量關聯(lián)的區(qū)域。

同時使用ED算法分析與含油量關聯(lián)的區(qū)域，利用兩混池間差異的SNP位點，統(tǒng)計各個堿基在不同混池中的深度，計算每個位點的ED值，ED值越大表明該SNP在兩混池間的差異越大。

ED值計算方法：

其中：Amut表示A堿基在突變性狀混池中的深度，Awt表示A堿基在野生性狀混池中的深度；Cmut表示C堿基在突變性狀混池中的深度，Cwt表示C堿基在野生性狀混池中的深度；Gmut表示G堿基在突變性狀混池中的深度，Gwt表示G堿基在野生性狀混池中的深度；Tmut表示T堿基在突變性狀混池中的深度，Twt表示T堿基在野生性狀混池中的深度。然而實際應用中，混池間的測序量差異會導致ED結果的偏倚，為了消除這種誤差，本項目使用各位點上每種堿基的頻率代替絕對深度值計算ED值，同時為消除背景噪音，對原始ED值進行5次方處理。然后采用局部線性回歸LOESS方法，利用位點的位置信息進行擬合分析。擬合的方法為：每一個SNP擬合后的關聯(lián)值等于前后各n個SNP的關聯(lián)值的中值。取95%的置信水平作為分析的關聯(lián)閾值。將超過閾值的區(qū)域篩選出來，可得到與含油量相關的區(qū)域。

將兩種關聯(lián)分析方法得到的區(qū)域進行比較，重疊區(qū)域作為與含油量相關的候選區(qū)域。利用基因組注釋網站BLAST，對候選區(qū)間內的基因和多態(tài)性位點進行注釋。

2 結果與分析

2.1 花生含油量性狀統(tǒng)計分析

母本P12是粉紅花皮小粒花生（圖1），索氏提取法測定含油量為51.90%；父本農大D666是紫黑種皮小粒花生，索氏提取法測定含油量為55.84%，親本之間含油量差異顯著。利用索氏提取法測得F2群體單株含油量最大為61.91%，最小為47.04%，群體含油量變異范圍較大，變異系數(shù)為3.90%（表1）。F2群體單株含油量性狀表現(xiàn)為連續(xù)變異，符合正態(tài)分布，屬于典型的數(shù)量性狀（圖2）。

圖1 親本籽仁比較

圖2 F2群體含油量頻次分布

表1 F2群體含油量分布特性

2.2 全基因組重測序和SNP、InDel檢測

根據(jù)測得的含油量數(shù)據(jù)，在F2群體中選取30個高油單株和30個低油單株分別構建高油和低油混池，并結合兩個親本進行BSA重測序分析。30個高油單株的含油量范圍57.23%～61.44%，平均值為58.37%，30個低油單株的含油量范圍47.04%～51.03%，平均值為49.83%。通過Illumina HiSeq平臺對親本及兩個混池進行全基因組重測序，農大D666、P12、低油混池、高油混池測序數(shù)據(jù)量分別為81.87、82.90、89.69、90.25 Gb，過濾后得到的Clean Reads數(shù) 分 別 為342 714 021、341 342 887、375 501 075、378 106 976，P12和農大D666的平均覆蓋深度為18×，兩混池的平均覆蓋深度為8×。4個樣本測序數(shù)據(jù)Q30為88.74% ～90.24%，GC含量36.42% ～37.74%，與參考基因組的比對率均為100%（表2）。

表2 測序數(shù)據(jù)評估及與參考基因組比對統(tǒng)計

親本P12和農大D666檢測到的多態(tài)性位點分別為509 634、331 882個，檢測到的SNP數(shù)目顯著多于InDel。篩選親本間純合差異位點，共得到271 376個SNP和58 903個InDel。271 376個SNP中有1 885個位于外顯子區(qū)，引起非同義突變的SNP共1 253個。58 903個InDel中有246個位于外顯子區(qū)，引起移碼突變的共239個。

2.3 與花生含油量關聯(lián)的候選基因組區(qū)域

對于親本間純合差異SNP位點，以低油親本P12為參考，計算兩子代混池的SNP-index，則ΔSNP-index=SNPindex（高油混池）-SNPindex（低油混池）。ΔSNP-index越大，兩混池差異越大，與花生含油量性狀相關性越強。選擇閾值以上的區(qū)域作為與花生含油量相關聯(lián)的區(qū)域。在01號染色體上有3個超過閾值的區(qū)域，這些區(qū)域在基因組上的分布為Arahy.01：15173647～15536277 bp、Arahy.01：15641571～15989924 bp、Arahy.01：16007500～18384005 bp，把相距小于100 kb的區(qū)域合并，得到一個候選區(qū)域Arahy.01：15173647～18384005 bp（圖3）。同時，進行ED關聯(lián)分析，利用混池間差異SNP的深度差異，計算兩混池間的ED值，結果顯示分布于01、03、04、08、13、18共6條染色體的48個區(qū)域出現(xiàn)超過閾值的顯著峰（圖4）。

圖3 兩個子代混池ΔSNP-index在整個基因組上的分布

圖4 兩個子代混池ED值在整個基因組上的分布

把兩種方法得到的重疊區(qū)域作為與花生含油量關聯(lián)的候選基因組區(qū)域，即Arahy.01：15173647～18384005 bp，總長3.21 Mb，在該區(qū)域中共檢測到318個SNP和53個基因。其中300個SNP分布在基因間區(qū)，9個SNP位于upstream，1個SNP位于5′UTR，6個SNP位于downstream，2個SNP位于內含子區(qū)。對候選基因組區(qū)域的編碼基因進行多個數(shù)據(jù)庫的深度功能注釋，從基因表達產物參與的生物過程分析，有19個基因的表達產物與蛋白質的合成代謝有關，與氧化還原酶類相關的基因有4個，與跨膜轉運相關的基因有3個，另外還有基因參與微管運動、細胞周期、糖類合成、信號轉導等過程。

通過基因功能注釋分析，在候選基因組區(qū)域內發(fā)現(xiàn)1個與脂質代謝相關的基因Arahy.55ECQ6。該基因位置是Arahy.01：15299758～15304403 bp，全長4 646 bp。Arahy.55ECQ6下游檢測到1個SNP位點。該位點低油池SNP-index為0.200，高油池為0.818，ΔSNP-index值為0.618，說明兩子代混池在該位點差異較大，可能與花生籽仁含油量有關。

3 討論與結論

本研究利用普通含油量花生品種P12與高油花生品系農大D666雜交構建了1個F2群體，通過BSA重測序分析，獲得1個與花生籽仁含油量相關的候選區(qū)域，在基因組上的分布為Arahy.01：15173647～18384005 bp，總長3.21 Mb，區(qū)間內檢測到318個SNP和53個注釋基因。李新平等［21］在A01染色體上也定位到了與花生含油量相關的QTL，但與本研究所得候選區(qū)域沒有重疊，說明本研究獲得的候選區(qū)域中存在新的QTL位點，可以進一步分析。

本研究預測的候選基因Arahy.55ECQ6編碼磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）X結構域結合蛋白。PI-PLC是一種真核細胞內酶。它催化1-磷脂酰-d-肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解成甘油二酯（DAG）和肌醇-1，4，5-三磷酸（IP3）。甘油二酯（DAG）是合成三酰甘油（TAG）的底物。在二酰甘油脂酰轉移酶（DGAT）的作用下，脂酰CoA加入到甘油的sn-3位上，生成三酰甘油。

本研究得到的候選基因組區(qū)域ΔSNP-index擬合曲線峰較平緩，可能由于該區(qū)域的基因位點是一個微效QTL。同時利用ED關聯(lián)分析方法獲得了多個超過閾值的顯著峰，說明還存在其他含油量相關基因位點，為花生含油量相關基因定位研究奠定基礎。