網絡藥理學方法研究三七治療關節炎的作用機制

韓 倩，陳 勇，王竟靜，魏江存，黃周艷，陳良妮

（1.廣西中醫藥大學科學實驗中心∕藥學院，南寧 530200；2.廣西國際壯醫醫院，南寧 530201）

中藥三七為五加科植物三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］的干燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，主要用于治療出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等病癥［1］，三七含有黃酮類、揮發油、多糖、皂苷類化合物。三七的黃酮類成分大部分以黃酮類醇的形式存在，從三七中分離到槲皮素、槲皮素苷、山柰酚、山奈酸以及山柰酚-3-O-β-D-半乳糖（2→1）葡萄糖苷等化合物。三七的黃酮類成分在莖葉、花蕾中含量稍微比根莖中高，為節約藥物資源，三七黃酮僅作為輔助開發。在主根中的揮發油類化合物有γ-依蘭油烯和莎草烯，而花中的揮發油含量最高，如β-欖香烯，可能對癌細胞也有抑制作用。三七多糖可干預炎癥反應，對白細胞活化因子有下調作用，其發酵液能夠抗衰老［2-9］。研究表明，三七及其提取物成分能夠抗氧化、抗炎鎮痛、抗腫瘤、活血止血等。三七的主要成分對于治療關節炎有顯著作用，三七治療血瘀型和風濕熱癥或兼血瘀型的關節炎效果明顯，且可改善臨床癥狀［10，11］。

通過運用網絡藥理學方法，探究三七主要成分治療關節炎的相關靶點和通路具有重要的意義，以此闡述三七治療關節炎的作用機制。網絡藥理學是在大數據時代的背景下產生的一種新興技術，最早由英國學者提出，以系統生物學、多項藥理學和分子生物學為基礎，運用多種數據庫和網絡計算平臺對藥物、成分、靶標、通路、疾病等數據加以整合分析，最后呈現出可視化的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡模型，從而能夠闡明以整體性為特點的中藥或中成藥的物質基礎和作用機制［12-14］。鑒于此，本研究運用網絡藥理學，構建“成分-靶點-通路”的多維網絡，探究三七治療關節炎的分子作用機制，為下一步從基因層面闡明生物學內涵提供一定的理論依據。

1 數據來源

1.1 三七主要活性成分收集及篩選

口服生物利用度（OB）是描述藥物口服后經肝臟而到達體循環血液中藥量占口服劑量的百分比，這也是衡量藥物發揮療效的指標，OB＞30%則可認為該藥物具有較好的利用度［15，16］；藥物相似性（DL）則代表了中藥中的某種成分與西藥的相似程度，該成分在機體內是否產生與相似西藥的活性，當DL＞0.18 則認為藥物相似性較高，溶解度較好［17，18］。

三七主要化學成分是運用中藥系統藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，http：∕lsp.nwu.edu.cn∕，Version 2.3）進行收集，再以口服生物利用度（OB）＞30%和藥物相似性（DL）＞0.18 為條件，最后篩得 8 個活性成分。

1.2 三七活性成分作用靶點預測

通過TCMSP 數據庫進一步預測活性成分相應的靶點，其中一些成分沒有查詢到相應靶點，用DrugBank 數據庫收集并補充相關靶點信息，刪除沒有靶點的化學成分 1 個，使用 UniProt 數據庫（http：∕∕www.uniprot.org∕）將7 個主要活性成分的相關靶點信息進行標準化處理（以人類作為物種限定標準）。

1.3 三七治療關節炎潛在相關基因的篩選

GeneCards 和OMIM 數據庫可以提供現有的基因 信 息 ，在 GeneCards（http：∕www. genecards.org∕，Version 4.5.0）、OMIM（http：∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕omim）數據庫中分別以“arthritis”進行檢索，合并檢索結果得到關節炎基因。取三七活性成分預測的相關靶點和關節炎相關基因的Veen 圖交集部分則是三七主要活性成分治療關節炎的作用靶點。

1.4 三七-有效活性成分-靶基因-關節炎網絡的構建

把7 個三七主要有效活性成分（已排除重復和假陽性）與關節炎作用靶點，先建立關系列表，后導入Cytoscape Version 3.6.0 軟件繪制三七有效活性成分-治療關節炎的網絡調控圖，并分析計算各作用靶標間的連接度（Degree），該值代表某個靶標與其他靶標間的相互作用，數值越高，代表該靶標可能在三七治療關節炎中發揮的作用越大。

1.5 蛋白互作網絡（PPI）繪制與分析

將三七治療關節炎相關靶點全部導入String 數據庫（https：∕string-db.org∕，Version 10.5）后，得到蛋白互作關系圖，使用R 語言對蛋白網絡互作連接度進行計算，最后得到核心基因。

1.6 生物過程和重要信號通路的分析

為探究三七治療關節炎的靶點在功能基因中的作用和信號調控通路，通過UniProt 數據庫得到三七治療關節炎靶點ID，以R 語言的Cluster Profiler 和pathway 包為工具得到基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結果。選擇P＜0.05 的GO 功能富集和KEGG 通路，在從多到少的基因數中選取前20 個，結合文獻進行分析。

2 結果與分析

2.1 三七活性成分篩選

在 TCMSP 數據庫中以OB＞30% 和DL＞0.18 作為篩選條件得到8 種化學成分（表1），表中還列出了細胞滲透性（Caco-2）和分子質量（MW），藥物穿過腸上皮屏障與 Caco-2 有關聯［16］，而 MW 在 180～500 kD，則可認為藥物有良好的給藥性［19］。

在8 種活性成分中，根據stigmasterol（豆甾醇）、ginsenoside rh2（人參皂苷rh2）、β-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）的4 個指標值綜合情況推測，這4 種成分的藥物特性較好，可能是三七發揮藥理作用的關鍵成分。

表1 三七中活性成分信息

2.2 三七活性成分-治療關節炎靶點預測

三七的7 個活性成分中通過TCMSP 數據庫、DrugBank 數據庫得到相應靶點共163 個；利用Gene-Cards、OMIN 數據庫檢索得到5 536 個關節炎作用靶點，得到三七活性成分和關節炎靶點Veen 圖，最后得到三七藥物活性成分-關節炎相關靶點131 個（圖1、表2）。

圖1 藥物-疾病靶點維恩圖

2.3 三七-有效活性成分-靶基因-關節炎網絡構建

將三七的7 個有效活性成分與其治療關節炎相關靶點連接，運用Cytoscape Version 3.6.0 軟件繪制三七-有效活性成分-靶基因-關節炎的中藥網絡調控圖（圖2）。能夠在三七治療關節炎中起比較關鍵的調控作用可能就是靶點連接較多的活性成分：quercetin（槲皮素）、β-sitosterol（β-谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）等。圖2 左邊中心點表示中藥三七，外圍7 個是三七活性成分；右邊中心表示關節炎，外圍表示三七治療關節炎潛在的131 個靶點；靶點與成分依靠邊線連接；圖中總共包含140 個節點。

2.4 PPI網絡構建與分析

將三七治療關節炎相關靶點全部導入String 數據庫后（默認限定物種為人），得到蛋白互作關系網絡（圖3），圖中靶標表示蛋白，邊線表示靶標間的相互關聯；最后使用R 語言對蛋白網絡互作連接度進行計算，最后得到蛋白激酶（AKT1）、JUN 蛋白（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、RELA、白介素-6（IL-6）、CXCL-8、表皮生長因子受體（EGFR）等前30 個基因蛋白柱狀圖（圖4）。從圖4 可以看出，前7 個連接度較高的靶標可以影響多個靶標，由此可以說明，三七治療關節炎是通過多個靶標相互作用產生復雜的轉錄翻譯復制的過程。

2.5 生物過程和重要信號通路的分析

為探究三七治療關節炎潛在的靶點在生物過程中和信號調控通路，以R 語言的Cluster Profiler 和pathway 包為工具進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，GO 分析得出生物過程氣泡圖（圖5），氣泡越大，基因占比大，則說明這個生物過程對治療關節炎具有重要意義；KEGG 分析得出信號通路富集結果（圖6），基因數目越多，提示該信號通路在該病中是重要的通路；選擇閾值P＜0.05，共富集到134 條生物過程，152條重要信號通路，再結合文獻進行分析。

2.5.1 GO 富集分析 將三七治療關節炎潛在的131 個靶點進行GO 富集分析，發現靶點主要涉及到：蛋白質異二聚活性（protein heterodimerization activity）、DNA 結合轉錄激活活性，RNA 聚合酶 II 特異性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、近端啟動子序列特異性DNA結合（proximal promoter sequence-specific DNA binding）、RNA 聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA 結合（RNA polymerase Ⅱ proximal promoter sequencespecific DNA binding）等134 條生物過程（圖5）。

2.5.2 KEGG 通路分析 通過對預測三七治療關節炎的131 個靶點進行KEGG 分析，在對其進行顯著性通路富集后，得到152 條信號通路，取前20 條通路的柱狀圖（圖6）。最后發現，三七治療關節炎的機制包括：糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complication）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、丙型

肝炎（Hepatitis C）、甲型流感（Influenza A）等通路。在眾多通路中，相關度居高的5 條，可能就是在所有通路中具有重要調控作用的信號通路，列舉腫瘤壞死因子信號通路（圖7），紅色表示三七靶基因在TNF 信號通路上的作用部位。AKT、IL-6、IL-8、EGF、VEGF、NF-kB 這些靶基因在多條通路中均有參與并發揮作用，說明三七治療關節炎是多靶點-多通路共同調控，從而治療關節炎。

表2 三七潛在治療關節炎作用靶點

圖2 三七有效成分-靶點網絡圖

圖3 三七治療關節炎潛在作用靶點之間的互作網絡

圖4 三七治療關節炎作用核心靶點

圖5 潛在靶點生物學的GO 分析氣泡圖

圖6 KEGG 通路富集分析結果

3 討論

圖7 腫瘤壞死因子信號通路

三七又名田七、三漆、滇三七等，在中國有600多年的藥用歷史，400 年的栽培歷史［20］，是中國名貴中藥之一，也是常見中成藥丹七片、復方丹參滴丸等的組分之一，因其有活血止血、散瘀止痛等功效被歷代醫家所推崇，至今三七用于治療心腦血管疾病、跌打損傷及出血等病癥。關節炎泛指發生在關節及其周圍組織，由炎癥、感染或其他因素引起的炎性疾病，主要表現為腫脹、畸變等；關節炎又分為骨關節炎（OA）、類風濕性關節炎（RA）、痛風性關節炎、化膿性關節炎等。有藥理研究表明，三七可能通過增加轉錄因子GAF 和熱休克蛋白70 的表達，可以明顯改善萎縮性胃炎大鼠胃黏膜狀態［21］；三七總皂苷可以調節大鼠關節炎的IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達，從而抑制組織腫脹［22，23］；三七抑制 NF-kB 的表達改善大鼠關節滑膜炎癥或抑制巨噬細胞釋放炎癥因子而起到治療效果［24，25］。研究表明，在類風濕關節炎的治療中，三七對 CCP∕AST 增殖及 IFN-γ 分泌的抑制可能發揮重要作用［26］。網絡藥理學通過在模型網絡中，建立起成分-靶點-通路的多維互作網絡，探究藥物與疾病之間的關聯，為后續研究提供科學依據。

本研究通過網絡藥理學方法檢索得到三七主要活性成分8 個，通過OB、DL、細胞滲透性和MW 4 個指標綜合比較，發現豆甾醇、人參皂苷rh2、β-谷甾醇、槲皮素可能是發揮藥理作用的關鍵成分。相關研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇可以改善DDS 引起的小鼠結腸炎［27］，β-谷甾醇還能調節巨噬細胞極化，抑制促炎因子（IL-6、IL-1β）的產生，減輕類風濕關節炎癥［28］。槲皮素治療可明顯減輕RA 的典型特征，如軟骨間關節損傷、炎性細胞浸潤；小鼠膝關節TNF-αmRNA 表達明顯降低［29］；槲皮素能降低天冬氨酸轉氨酶、硫代巴比妥酸活性物質和活性氧的水平，在小鼠關節炎模型中起到抗氧化、基因保護和細胞保護作用［30］；通過抑制 NF-kB 激活，減弱炎癥環境中 MMP-13、細胞凋亡［31］；能夠降低 RA 破骨細胞的生成和分化，提示可治療類風濕性關節炎［32］。由此可以說明，三七依靠多成分共同發揮作用來治療關節炎。而人參皂苷f2、人參皂苷rh2 對于抗皮膚炎癥、抗支氣管炎癥反應也有一定的作用［33，34］，尚未見對于關節炎的報道，可以將人參皂苷作為未來研究治療關節炎的提示成分。與7 個活性成分相關的作用靶點163 個，篩選得到關節炎靶點5 536 個，獲得三七藥物活性成分-關節炎相關靶點131 個，從“三七-有效活性成分-靶基因-關節炎”的中藥網絡調控圖中，能夠看出靶點連接較多的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，可能就是這些成分起主要調控作用。

以R 語言為工具，進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，最后獲得了134 條生物過程和152 條重要信號通路；GO 富集分析涉及蛋白質異二聚活性、DNA結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、細胞因子受體結合、近端啟動子序列特異性DNA 結合、RNA 聚合酶II 近端啟動子序列特異性DNA 結合等關鍵生物過程；KEGG 通路富集結果顯示，三七相關成分靶點主要涉及生物代謝途徑：糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、腫瘤壞死因子信號通路等重要信號通路。腫瘤壞死因子（TNF）是一種非常關鍵的信號因子，它能誘導細胞內的信號通路，參與細胞凋亡、分化等；在RA 患者的滑膜、軟骨中TNF 表達異常，并影響滑膜中的各種細胞，進一步破壞關節［35-37］。TNF-α 是由激活的單核巨噬細胞分泌，能夠引起局部炎癥還通過激活MAPK 信號通路導致滑膜組織炎性增生、關節骨與軟骨的破壞；TNF 的受體之一TNFR1 可以激活其他基因，使MAPK 通路控制軟骨細胞凋亡［38］。這些通路都與炎癥密切相關，從生物過程和信號通路的分析可以說明，三七是通過多種成分作用于多個靶點，并且靶點又作用于不同的生物過程和信號通路，協同發揮藥效。

本研究從網絡藥理學的角度，研究對三七治療關節炎的作用靶點和信號通路，網絡預測了三七的7 種成分作用于關節炎的131 個靶點，涉及到發揮藥效的多條生物過程和通路，也為后續研究三七治療關節炎的生物學過程和信號通路提供了一些參考。