熊果苷合成酶固定化條件研究

李 皓，盛希群，劉 靜，鐘 星

（湖北大學知行學院生物與化學工程學院，武漢 430011）

熊果苷最初是從熊果葉子中提取出來的一種糖苷類化合物［1］，其學名為4-羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷［2］。隨著研究的深入，在多種植物中均發現有熊果苷的存在。

起初作為藥用價值時，發現其具有止咳［3］和平喘的功效［4］。隨著現代科學的發展，人們發現其還具有抗氧化作用［5］和美白效果。

熊果苷能夠在不具備黑素細胞毒性的濃度范圍內抑制黑色素細胞中酪氨酸酶，阻斷多巴以及多巴醌的合成，從而抑制黑色素的生成，達到增白皮膚的效果［6］。它通過將自身與酪氨酸酶直接結合來競爭多巴的結合位點，并加速皮膚下黑色素的分解和排出，從而在一定程度上能減少皮膚中色素的沉積［7］。而α-熊果苷的美白作用優于β-熊果苷十幾倍，并且不會抑制人體內的細胞生長，無副作用。同時α-熊果苷與β-熊果苷相比也更加穩定，具有更高的耐熱性［8］。熊果苷的生產方法已經發展出多種方式，熊果苷也成為美白產品中必不可少的添加物［9，10］。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑購自國藥集團和生工生物工程（上海）股份有限公司，菌株和載體為湖北大學知行學院生物與化學工程學院實驗室保存。

1.2 熊果苷酶法生成

在工業菌株誘導后，產生的轉葡萄糖苷酶能將對苯二酚和麥芽糖按照2∶1 的摩爾比反應生成單一產物α-熊果苷，化學反應式如圖1 所示。

圖1 對苯二酚與麥芽糖經轉葡萄糖苷酶合成α-熊果苷

1.2 海藻酸鈉固定化

①稱取一定量海草酸鈉加熱攪拌溶解于去離子水中；②稱取一定量氯化鈣溶解于冰置去離子水中；③將冷卻后的海藻酸鈉膠體與一定量酶液用磁力攪拌器均勻混合，獲取一定濃度的膠體；④利用恒流泵維持一個適當的流速，并將出液口綁定在一個合適的高度；⑤利用海藻酸鈉膠體滴定冰置后的氯化鈣溶液，獲得固定化珠；⑥待固定化珠凝固，取出并用去離子水沖洗；⑦將沖洗后的固定化珠放置于濾紙上，冷藏于-20 ℃冰箱進行鈣化處理；⑧鈣化操作結束后，將固定化珠放入戊二醛溶液進行交聯處理；⑨用去離子水沖洗，置于培養皿內，低溫保藏。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌誘導表達及提取

進行IPTG 誘導劑處理，當搖床培養完成后，檢測其OD，檢測結果為0.583，符合IPTG 添加標準。保留5 mL 原始菌液，其余10 mL 菌液按照1‰比例加入10 μL IPTG 誘導劑混合均勻，置于搖床以37 ℃恒溫和 225 r∕min 振蕩培養 6 h。

取出誘導完成的菌液，進行超聲波細胞破碎處理，設定功率為80 W，占空比為50%，破碎時間3 min。后期大批量處理時使用大號離心管，每次破碎8 mL，功率為100 W，占空比50%，破碎8 min。經檢測，重組酶已成功表達。

2.2 固定化試驗結果

以3.0%海藻酸鈉滴定300 g∕L 氯化鈣溶液所制成的固定化珠為例，選取其某批次固定化珠中滴定效果較好的15 顆固定化珠，放置成一排。總長度約為5.3 cm，其單個固定化珠的平均直徑約為3.53 mm。再將這些珠子用電子天平稱重，得到0.376 7 g的總重量，以此得出單顆固定化珠的重量約為0.025 1 g。并進行多批次滴定固定化珠，將各組固定化珠數據進行匯總，至少以3 組以上的平行數據為依據，進行固定化珠大小及重量的統計。

經過初期試驗，海藻酸鈉的溶解上限約為4.25%，因此設定多個海藻酸鈉膠體濃度梯度（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%），將海藻酸鈉膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱冰置，利用恒流泵滴定400 g∕L 氯化鈣溶液，固定化反應30 min 后將固定化珠置于-20 ℃下進行1 h 鈣化操作，并且不交聯。記錄各組固定化珠的數據，并統計其制作消耗。由表1 可知，每毫升膠體固定化后的重量約為0.332 g，并以此為標準，稱取0.332 g 固定化珠作為1 mL 酶液參與酶活檢測試驗，之后用1 mL 去離子水洗滌固定化珠加入體系。

表1 各濃度海藻酸鈉膠體固定化珠數據

對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度。由圖1 可知，用3.0%濃度的海藻酸鈉膠體滴定400 g∕L氯化鈣溶液，固定化效果最好，因此選取3.0%的海藻酸鈉膠體進行進一步研究。

圖2 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響

已知氯化鈣溶液濃度決定固定化效率，且氯化鈣的溶解上限約為600 g∕L，但氯化鈣溶液過高會使固定化反應過于劇烈。以3.0%海藻酸鈉膠體滴定不同濃度（600、500、400、300、200 g∕L）的氯化鈣溶液，將海藻酸鈉膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱，固定化反應30 min 后將固定化珠置于-20 ℃進行1 h鈣化操作，且不交聯。記錄各組固定化珠的數據，并統計其制作消耗。由表2 可知，隨著氯化鈣濃度的增加，得到的固定化珠平均質量和直徑也逐漸增加。

對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結果見圖3。由圖3 可知，在海藻酸鈉膠體濃度為3.0%、氯化鈣溶液濃度為300 g∕L時，固定化效果最佳。

表2 各濃度氯化鈣溶液固定化珠數據

圖3 氯化鈣濃度對固定化酶活性的影響

在此基礎上，添加明膠作為輔助成分。經初期測定，明膠的溶解上限約為25%，但當明膠濃度超過5%時，混合膠體無法成功固定化，因此設定明膠梯度為0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0% 和5.0%，將海藻酸鈉-明膠混合膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱冰置，固定化反應30 min 后將固定化珠置于-20 ℃條件下進行1 h 鈣化操作，且不交聯。記錄各組固定化珠的數據，并統計其制作消耗，滴定效果見表3。由表3可知，隨著明膠濃度的增加，得到的固定化珠的平均質量和直徑也逐漸增加。

表3 各濃度明膠膠體固定化珠數據

對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結果見圖4。由圖4 可知，在3.0%海藻酸鈉膠體和300 g∕L 氯化鈣溶液的基礎上，輔助加入低含量的明膠可提升固定化效果。其中，明膠濃度為3%時的固定化效果最佳。

2.3 固定化時間

圖4 明膠濃度對固定化酶活性的影響

在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 濃度冰置氯化鈣溶液的基礎上，設定固定化時間梯度為10、20、30、40、50、60 min，在室溫條件下進行固定化時間探究試驗。對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為酶活力值，檢測結果見圖5。由圖5 可知，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下制成的固定化珠，其固定化反應的最佳時長為20 min。

圖5 固定化時間對固定化酶活性的影響

2.4 固定化鈣化時間

在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 濃度冰置氯化鈣溶液的基礎上，設定鈣化時間梯度為 10、20、30、40、50、60 min，在-20 ℃條件下進行鈣化試驗。對各組固定化珠進行最適條件和抗性條件下的雙重檢測，并將吸光度換算為酶活力，檢測結果見圖6。由圖6 可知，在由3.0%濃度海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠，其鈣化操作時間的最佳時長為50 min。

圖6 鈣化時間對固定化酶活性的影響

2.5 固定化交聯效果

以固定化成分3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 冰置氯化鈣溶液，固定化20 min，并鈣化50 min，在此基礎上，設定戊二醛交聯濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%，在室溫下進行戊二醛交聯試驗，將固定化珠浸泡于相應濃度的戊二醛溶液中，暫定交聯時間為1 h。對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結果見圖7。由圖7 可以看出，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠鈣化50 min 后，在多個濃度梯度的戊二醛交聯劑中，保持最佳固定化效果的濃度為1%。

圖7 交聯濃度對固定化酶活性的影響

在1%戊二醛交聯劑濃度的基礎上，設定交聯時間梯度為0、20、30、40、50、60 min，在室溫下進行戊二醛交聯試驗。對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度（圖8）。隨著交聯時間的增加，固定化珠的強度逐漸增加，但是固定化酶的酶活性和耐受性逐漸下降，綜合考慮，交聯時間固定為20 min。

圖8 交聯時間對固定化酶活性的影響

2.6 固定化緩沖液探究

以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定冰置300 g∕L 氯化鈣溶液，固定化20 min，并鈣化50 min，在此基礎上，設定磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-檸檬酸和磷酸二氫鉀-氫氧化鈉等多個pH 為7.0 的緩沖液類型組，替換膠體溶解溶液，制作各組緩沖液類型的固定化珠。對各組固定化珠進行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結果見圖9。由圖9 可以看出，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠效果較好，在此基礎上，將膠體溶解液由去離子水改為pH 為7 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液后，固定化效果得到提升。

圖9 緩沖溶液類型對固定化酶活性的影響

2.7 固定化緩沖液pH 探究

在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定冰置的300 g∕L 氯化鈣溶液，固定化20 min，并鈣化50 min，在此基礎上，選取磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為對象，將海藻酸鈉和明膠顆粒溶解其中，設定緩沖液pH 梯度為6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，在室溫條件下進行緩沖液pH 試驗。滴定效果見表4。由表4 可以看出，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠溶于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下，在多個pH 梯度試驗中，僅在pH 為7 時固定化成功。

表4 pH 對固定化珠滴定效果的影響

2.8 固定化酶與游離態酶活性對比

在確定了最佳固定化條件以及其最佳保存條件的基礎上，設計對固定化酶實際效果的探究試驗，通過對-20 ℃凍存粗提酶液以及固定化珠，再用40 ℃解凍，并進行酶活檢測，在-20 ℃凍存酶液和固定化珠，以30 min 作為每次再凍存的時間標準，在最適條件下反復檢測其酶活，觀察酶活損失情況，以探究固定化珠的實際運用效果。將吸收峰面積換算為酶活存活率，檢測結果見圖10。由圖10 可以看出，反應6次時，游離態酶已完全失活，而固定化酶仍保留有較高活性，表明在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠溶解于pH 為7 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液所制成的混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 并鈣化操作50 min 所制成的固定化珠與未固定化的酶液相比，具有明顯的保護作用。

圖10 固定化酶與游離態酶活性的對比

3 小結與討論

在本研究中，將轉化至Escherichia coliBL21 Gold（DE3）中的aglA基因的質粒表達葡萄糖苷酶用以催化生產α-熊果苷。再利用超聲波破碎技術和鎳離子層析柱提取并純化轉葡萄糖苷酶，并將其采用海藻酸鈉-明膠混合固定，使其可重復使用。該方法有很好的應用前景，為工業化制備奠定了良好的基礎。