地龍參麥口服液質量標準提高研究

劉 棟，華之卉，郝 哲，屈 俊，王麗軍，李明春 （. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八八醫院藥劑科，河南 鄭州 45004；. 鄭州人民醫院藥學部，河南 鄭州 45000；. 中國人民解放軍海軍第九七一醫院藥劑科，山東 青島6607）

地龍參麥口服液（曾用名：健心樂口服液）是由地龍、紅參、黃芪、麥冬、五味子等五味中藥材加工制成的復方非標準制劑，具有利尿、降壓、強心、補益氣血、養心安神之功效[1-2]，在臨床上用于各種病因引起的慢性心功能不全、心慌、胸悶、胸痛及各種心律失常，并有利水、抗凝、營養心肌之功效。原質量標準制定年代久遠，只有檢查項，不能全面控制制劑質量。根據全軍醫療機構制劑標準提高課題要求，增加了麥冬、黃芪和五味子的薄層色譜（TLC）鑒別方法。五味子醇甲是方中五味子的有效成分之一，能夠保護心肌結構和功能，降低心肌耗氧量，延長供體心的保存時間[3]；羥苯乙酯為方中的化學防腐劑，具有廣譜抑菌作用，但過量使用會產生變態反應以及類激素作用[4]。為保證制劑的有效性和安全性，本研究采用HPLC 法同時測定制劑中有效成分五味子醇甲和防腐劑羥苯乙酯的含量，為提高和完善地龍參麥口服液的質量標準提供可靠的試驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10A 型高效液相色譜儀，包括SPD-10A 型紫外檢測器、手動進樣器、LC-solutionLite 色譜工作站（日本Shimadzu 公司）；BT125D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；ZF-2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（天津華北實驗儀器有限公司）；硅膠G 薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品（含量：95.8%，批號：110781-201314）、五味子醇甲對照品（含量：99.9%，批號：110857-201513）、羥苯乙酯對照品（批號：100847-201604，含量：99.9%）、黃芪對照藥材（批號：121462-201304）、麥冬對照藥材（批號：121013-201310）、五味子對照藥材（批號：120922-201309）均購自中國食品藥品檢定研究院；地龍參麥口服液（批號：170926、171208、180312）和陰性樣品為中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八八醫院自制；乙腈為色譜純；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別[5-6]

2.1.1 黃芪[7]

取本品30 ml，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3 次，每次20 ml，再用水洗滌2 次，每次20 ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取黃芪對照藥材2.0 g，加水飽和的正丁醇60 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。再取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按照TLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗，吸取上述4 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（25∶11∶3）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，見圖1。

2.1.2 麥冬

取本品20 ml，加30%鹽酸溶液3 ml，加熱煮沸5 min，放冷，用二氯甲烷振搖提取2 次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取缺麥冬的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取麥冬對照藥材2 g，加水50 ml，煎煮30 min，濾過，濾液加30%鹽酸溶液6 ml，同法制成對照藥材溶液。按照TLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗，吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-丙酮（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，見圖2。

2.1.3 五味子[8]

取本品30 ml，用二氯甲烷振搖提取2 次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取缺五味子的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取五味子對照藥材1.0 g，加二氯甲烷30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷1 ml 使溶解，作為對照藥材溶液。再取五味子醇甲對照品，加二氯甲烷制成每1 ml 含1 mg 五味子醇甲的溶液，作為對照品溶液。按照TLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗，吸取上述4 種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（10∶7∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。結果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Wondasil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流 動 相：乙 腈(A)-水(B)，梯 度 洗 脫：0～10 min，35%A；10～20 min，35%A→47%A；20～30 min，47%A→55%A。流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2.2 溶液的制備

（1）混合對照品溶液：精密稱取羥苯乙酯、五味子醇甲對照品各適量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml 含羥苯乙酯、五味子醇甲分別為505.89、116.12 μg 的混合對照品儲備液。精密量取上述混合對照品儲備液2 ml，置于10 ml 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得羥苯乙酯、五味子醇甲質量濃度分別為101.18、23.22 μg/ml 的混合對照品溶液。

（2）供試品溶液：精密量取樣品2 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

（3）陰性對照溶液：分別取缺羥苯乙酯、缺五味子的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖4。結果表明，在該色譜條件下，供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處出峰，陰性對照溶液對羥苯乙酯、五味子醇甲的測定無干擾。

圖4 地龍參麥口服液HPLC 圖

2.2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.2”項下混合對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，進樣，記錄峰面積。以羥苯乙酯和五味子醇甲質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得羥苯乙酯回歸方程為Y=58 559.18X-90 593.32 (r=0.999 9)，五味 子 醇 甲 回 歸 方 程 為Y=27 155.08X-7 196.072(r=0.999 9)。結果表明，羥苯乙酯和五味子醇甲檢測質量濃度線性范圍分別為25.29～252.94、5.81～58.06 μg/ml。

2.2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品溶液，連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果顯示，羥苯乙酯和五味子醇甲峰面積的RSD 分別為0.62%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

取已知含量的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時按進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，羥苯乙酯和五味子醇甲峰面積的RSD 分別為1.03%、0.85%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗

取同一批樣品，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果顯示，羥苯乙酯和五味子醇甲的含量平均值分別為0.468 8、0.115 6 mg/ml，RSD 分別為0.75%、0.85%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（批號：170328）1.0 ml，共9 份，分別置于10 ml 量瓶中，各加入低、中、高質量的羥苯乙酯和五味子醇甲對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.3 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

3 討論

3.1 TLC 鑒別

黃芪TLC 鑒別時，樣品的正丁醇提取液用1%氫氧化鈉溶液洗滌，既可以除去酸性、酚類非指標成分，又能促進其他黃芪皂苷轉化成黃芪甲苷，增加黃芪甲苷的量[9-11]，提高鑒別效果。

試驗過程中，曾進行過紅參和地龍的薄層鑒別研究。在對紅參的鑒別中，采用不同的展開系統陰性均出現干擾；而在地龍的研究中采用不同供試品處理方法、不同的展開系統均無法顯示出地龍的特征性斑點，故質量標準中舍棄了對紅參和地龍的薄層鑒別。

3.2 含量測定

本試驗考察了甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-水3 種不同的流動相體系，在滿足基線平穩、指標峰分離度良好、峰型對稱度好的基礎上，從經濟環保的角度出發，選用乙腈-水體系。但羥苯乙酯和五味子醇甲極性有一定差別，故采用梯度洗脫法來達到快速檢測的目的。

由紫外吸收圖譜可知，羥苯乙酯和五味子醇甲在254 nm 附近均有最大吸收，故選擇254 nm 作為檢測波長，操作更加簡單、普適性更強[12]。

表1 加樣回收率試驗結果(n=9)

表2 樣品含量測定結果(n=3, mg/ml)

試驗中考察了水、甲醇、乙醇、稀乙醇和50%甲醇作為提取溶劑，結果顯示50%甲醇作溶劑時，指標成分無干擾，提取率高。

本研究曾嘗試測定紅參中有效成分的含量，將樣品采用直接過濾法、蒸干后甲醇超聲法、正丁醇萃取法等均無法有效檢測出紅參中的有效成分，故最終放棄對紅參的含量測定。

3.3 羥苯乙酯含量測定的意義

《中國藥典》（2015 年版）四部通則0181【合劑】項下規定羥苯酯類防腐劑的用量不得超過0.05%，但所有抑菌劑都有一定的毒性，添加到制劑中的抑菌劑應是在抑菌效力測試試驗基礎上的最低有效量[13]。樣品處方中羥苯乙酯的用量為0.05%，但3 批樣品的測定結果顯示羥苯乙酯的含量差異較大，因而把羥苯乙酯含量也作為質量控制項符合制劑的安全性要求。