HPLC 法測定人血漿中奧卡西平活性代謝產物單羥基卡馬西平的濃度

姚囡囡，周 宇，付文倩，黃 珊，宋洪濤 （中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院藥學科，福建 福州 350025）

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；H1850R 型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海恒科儀器有限公司）；SHBB95A 型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；Discovery DV215CD 型分析天平（美國OHAUS 公司）；Vortex-5 型渦旋混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 材料

MHD 對照品（美國CATO 公司）；內標：奧硝唑（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，上海科豐化學試劑有限公司）；空白血漿（醫院血庫提供）；超純水（實驗室自制）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），預柱為Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流動相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μl；雙波長檢測：在192 nm 處檢測MHD，318 nm 處檢測奧硝唑。

2.2 溶液及血漿樣品的配制

2.2.1 儲備液的配制

精密稱取MHD 對照品10 mg 于10 ml 的量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為1 mg/ml 的儲備液，置于-20 ℃下保存。

2.2.2 內標工作液的配制

精密稱取奧硝唑1.4 mg 于10 ml 的量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為140 μg/ml 的內標工作液，置于-20 ℃下保存。

2.2.3 血漿標準曲線和質控樣品的配制

多風電場無功優化問題,即包括海上風電場在內的各個風電場利用風機自身無功調節能力及無功補償設備,如高壓并聯電抗器(以下簡稱“高抗”),實現對區域電網內無功功率的優化調節,從而達到提高區域電網節點電壓質量和減少網絡損耗的目的。崇明島、北支廠址兩個海上風電場所采用的無功補償方式為固定高抗和可投切高抗聯合補償的方式,能夠靈活調節輸出無功功率[9]。

分別精密量取適量儲備液，用甲醇稀釋成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml 濃度梯度的標準對照溶液。取以上6 個標準對照溶液，加入適量空白血漿，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml 系列濃度的血漿標準曲線樣品。同法配制相應的低、中、高濃度的血漿質控樣品（QC），使得MHD 對應的濃度分別為5、15、40 μg/ml。

2.3 血漿樣品的預處理

取200 μl 血漿樣品，加入200 μl 內標工作液、400 μl 甲醇，渦旋混合30 s，10 ℃條件下13 000 r/min離心10 min，取上清液直接進樣。

3 結果

3.1 專屬性試驗

通過考察6 份不同生物來源的空白血漿樣品色譜圖、空白血漿樣品加入MHD 對照品和內標的色譜圖，以及臨床實際用藥后的患者血漿樣品色譜圖，以此反映方法的專屬性。由圖1 可見，在本實驗條件下，被測物MHD 與內標的色譜峰分離良好，且血漿中的內源性物質不干擾測定。MHD 和內標的保留時間分別為9.5 min 和6.1 min。

圖1 奧卡西平代謝產物單羥基卡馬西平的HPLC 圖

3.2 標準曲線與線性范圍

取上述濃度為2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血漿標準曲線樣品按“2.3”項下方法處理。經HPLC 法分析，以測得OXC 的峰面積與內標峰面積之比（Y）作為縱坐標，以血漿MHD 濃度（X）為橫坐標，得到回歸方程為：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。線性范圍：根據標準曲線，MHD 血藥濃度在2～50 μg/ml 范圍內線性關系良好，其定量下限濃度為2 μg/ml。

3.3 日內、日間精密度和準確度

配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4 種濃度的QC 樣品各6 個，按“2.3”項下方法處理后測定，連續測定3 d，以當天的標準曲線計算QC 樣品的測定濃度，計算日內、日間精密度以及準確度。經測定，MHD 的日內、日間精密度RSD均小于15%，準確度在95.57%～100.59%之間，均符合生物樣品的測定要求，結果見表1。

表1 單羥基卡馬西平日內、日間精密度和準確度（n=6）

3.4 提取回收率

配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 種濃度的QC 樣品各6 個，按“2.3”項下方法處理。同時另取18 份空白血漿，除了不加系列對照品溶液和內標外，按“2.3”項下方法處理，在獲得的上清液中加入MHD 和內標溶液至相應濃度。進樣分析，以每一濃度中2 種不同處理方法的峰面積比值計算提取回收率。經測定，本法中MHD 的平均提取回收率在89.62%～95.32%之間；內標的平均提取回收率為98.76%，符合生物學樣品的分析要求，結果見表2。

表2 單羥基卡馬西平、MHD 和內標提取回收率試驗結果（n=6）

3.5 穩定性試驗

3.5.1 室溫穩定性試驗

取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 種濃度的QC 樣品各5 份，測定即時血藥濃度，并在室溫條件下放置4 h 和10 h 后測定樣品血藥濃度，求得RSD 和RE 值。經測定MHD 血漿樣品在室溫下放置10 h 后仍穩定，RSD 均小于4.47%，RE 值在1.50%～2.98%之間，結果見表3。

表3 奧卡西平代謝產物單羥基卡馬西平穩定性試驗結果 (n=5)

3.5.2 凍融穩定性試驗

取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 種濃度的QC 樣品各5 份，測定即時血藥濃度，并于-20 ℃冰箱中冷凍保存24 h 后室溫下解凍1 h 后測定，反復凍融3 次，求得RSD 和RE 值。經測定MHD 血漿樣品反復凍融3 次后仍能保持穩定，RSD 均小于2.83%，RE 值在1.86%～9.41%之間，結果見表3。

3.5.3 處理后的血漿樣品在自動進樣器中儲存的穩定性試驗

取低、中、高3 個濃度水平的血漿QC 樣品（5、15、40 μg/ml）各5 份，測定即時血藥濃度，然后放置在自動進樣器內12 h、36 h 后再次測定，求得RSD 和RE 值。經測定處理后的MHD 血漿樣品在進樣器內放置36 h 仍能保持穩定，RSD 均小于5.09%，RE 值在-1.34%～7.74%之間，結果見表3。

3.5.4 長期穩定性試驗

取低、中、高3 個濃度水平的血漿質控樣品（5、15、40 μg/ml）各5 份，測定即時血藥濃度，并置于-20 ℃冰箱中凍存30 d 后取出解凍后測定，求得RSD 和RE 值。經測定MHD 血漿樣品在-20 ℃冰箱中凍存30 d 后仍能保持穩定，RSD 均小于4.39%，RE 值在-2.53%～3.19%之間，結果見表3。

4 討論

目前，有關MHD 的檢測方法的文獻很多，其中,高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯用法都有報道，后者雖有靈敏度高、專屬性強的特點，但其儀器昂貴，且需專業人員進行操作，很難在大部分的醫療機構普及[13-15]。另外，國內外文獻報道中多使用固液萃取法或液液萃取法進行血樣的前處理，但這種處理過程相對復雜、耗時，且經濟成本較高[11,16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白進行血樣的前處理，建立了HPLC 法測定人血漿中MHD 血藥濃度的方法，整個過程操作簡單、快速，樣品分析時間較短，適用于臨床大量樣品的連續檢測。

文獻報道的流動相有乙腈-10 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比進行試驗，發現當水-乙腈的比例為80∶20 時，色譜峰的峰形、出峰時間及分離度最佳。文獻采用卡馬西平[17]、苯巴比妥[19]和奧硝唑[20]等作為內標，本研究通過篩選發現奧硝唑的保留時間為6.1 min，不僅與MHD 的保留時間相近，又能與其有很好的分離，且其性質穩定，滿足內標的要求。

本實驗建立的測定人血漿中OXC 活性代謝產物MHD 的HPLC 法，MHD 線性回歸方程中的r=0.998 6，說明血藥濃度在2～50 μg/ml 范圍內具有良好的線性關系，日內、日間精密度RSD 均小于15%，準確度在95.57%～100.59%之間，MHD及內標的平均提取回收率在89.62%～98.76%之間。血漿樣品的穩定性試驗證明，在室溫放置10 h、反復凍融、處理后放置進樣器36 h 以及低溫保存30 d 的情況下，樣品未見明顯降解，仍能保持穩定。本研究建立的HPLC 法操作快速簡單，精密度、回收率高，穩定性好，專屬性強，不受血漿中內源性物質的干擾，結果準確可靠，且靈敏度高，適用于奧卡西平臨床血藥濃度的監測。

目前癲癇治療主要以藥物治療為主，奧卡西平是第二代抗癲癇藥物，我國諸多癲癇病專家也建議將其作為癲癇部分性發作和全面強直陣攣發作的首選藥物[21]。但奧卡西平使用過程中可能出現瘙癢、蕁麻疹、血管性水腫等超敏反應，包括Stevens Johnson 綜合征中毒性表皮壞死松解癥[22]等，還可引起低鈉血癥、頭暈、胃腸道不適等不良反應，有文獻報道，其療效及不良反應可能與血藥濃度密切相關[23]，因此開展奧卡西平血藥濃度的測定，能提高藥物治療的療效，同時可以有效避免或減少可能產生的藥物不良反應，提高癲癇患者服藥的依從性。本研究建立了測定人血漿中MHD 血藥濃度的方法，應用于臨床，為臨床個體化給藥提供依據，值得臨床推廣使用。