紅景天苷單體與坤復康片大鼠口服藥動學特征的比較

劉昕竹，徐人杰,，馮 城，魏 昕 （. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院藥學部，上海 0009；. 紹興市婦幼保健院臨床藥學室，浙江 紹興 3000）

中藥及其制劑由于其特殊的功效，低毒性和較少的副作用而在世界范圍內越來越流行[1]。坤復康片是著名的中藥配方，包括赤芍、苦參、香附、豬苓、女貞子、南劉寄奴、烏藥、粉萆解、扁蓄，臨床用于治療中國女性的骨盆炎癥[2-3]。紅景天苷（圖1）是坤復康片抗炎作用的重要生物活性化合物。研究證明，紅景天苷包含許多藥理作用，例如抗血栓[4]、抗成骨細胞凋亡[5]、保肝[6]和抗腫瘤[7]。

圖1 紅景天苷結構式

中藥藥動學研究不僅可以解釋和預測有關功效和安全性的藥物事件，而且還有助于評估處方或者中草藥的合理性和相容性[8-10]。口服是應用中藥的主要途徑，并通過口服發揮藥理作用。但是，口服坤復康片后，紅景天苷的藥動學特征尚未見報道。同時，坤復康片中其他成分對紅景天苷吸收的影響目前也未被揭曉。

我們旨在開發一種選擇性高、靈敏且快速的UPLC-MS/MS 方法，用于測定大鼠血漿中的紅景天苷。隨后，本方法成功地用于該活性成分在大鼠體內的藥動學研究。同時，通過比較大鼠口服給予紅景天苷單體和坤復康片后的藥動學行為，我們探究了坤復康片對紅景天苷藥動學特征的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

紅景天苷標準品和內標葛根素標準品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為純化水；坤復康片為市售品（薄膜衣片，規格：0.4 g/片，批號：20190610）；空白大鼠血漿取自健康Wistar 大鼠，用前經檢測對實驗無干擾。

1.2 動物

Wistar 雄性大鼠（180～220 g，上海交通大學公共實驗室）。

1.3 儀器

Applied Biosystem 5500 QTRAP? hybrid triple-quad LC/MS/MS（美國AB 科學技術公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（美國安捷倫科技有限公司，50 mm×2.1 mm, 1.8 μm）。

2 方法

2.1 色譜條件

流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B）。梯度洗脫：0.0～2.4 min, 1.0%～23.4% A; 2.4～2.5 min, 23.4%～95.0% A; 2.5～3.5 min，95.0% A; 3.5～3.6 min,95.0%～1.0% A; 3.6～4.6 min, 1.0% A。用 前 經0.22 μm 微孔濾膜過濾。在線脫氣；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μl。

2.2 質譜條件

ESI 離子源：負離子模式；采集方式：多反應監測（MRM）；離子化溫度（TEM）：550 ℃；噴霧電壓：-4 500 V；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助氣（GS2）：50 psi；氣簾氣（CUR）：50 psi。紅景天苷m/z 299.2 →59.0，內標葛根素m/z 415.1 → 267.1，碰撞能量（CE）:-29 V（紅景天苷），-40 V（葛根素）。

2.3 標準溶液的配制

精密稱取紅景天苷對照品適量，加水定容至10 ml 制成對照品溶液，濃度為100 μg/ml，4 ℃冷藏備用。

2.4 血漿樣本處理

取血漿樣品50 μl，加入70 ng/ml 葛根素內標溶液10 μl，渦旋混勻，加入400 μl 甲醇，渦旋提取1 min。12 000 r/min 離心10 min，吸取2 μl 上清液進樣LC-MS/MS 分析。

2.5 方法學考察

根據FDA 發布的生物分析方法標準，設定紅景天苷3 個質控濃度（5、50、200 ng/ml），通過將標準溶液用空白血漿稀釋的方式配制質控樣本，對方法的專屬性、精密度、準確性、穩定性、提取回收率、線性關系進行了考察（FDA，2001 年）。驗證試驗連續進行3 d。每次驗證均重復6 份質控樣品。

2.6 試驗設計

12 只雄性Wistar 大鼠，隨機分為2 組，適應性飼養3 d 后，于實驗前12 h 禁食，自行飲水。紅景天苷單體和坤復康片事先用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，2 組大鼠分別灌胃給予紅景天苷單體和坤復康片混懸液，劑量分別為0.95 和120 mg/kg。其中，坤復康片劑量為單次口服臨床等效量。大鼠于給藥前和給藥后0、0.17、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h 眼眶取全血150 μl，立即置于含肝素的試管中，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，分離血漿50 μl，-20 ℃保存，備測。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性

在本研究中，我們嘗試了各種流動相條件以獲得分析物的最佳響應、合適的保留時間和良好的峰形。主要測試了甲醇、乙腈、0.1%甲酸和100%水作為潛在的流動相。結果表明，0.1%甲酸和甲醇作為流動相可以產生更高的響應和更好的峰形。因此，選擇了甲醇-0.1%甲酸水。對于MS 條件，測試了正掃描和負掃描模式。由于處于負離子模式的紅景天苷顯示出更明顯的碎片特征和更高的靈敏度，因此選擇了該模式。空白血漿、紅景天苷和內標血漿的典型色譜見圖2。其中，紅景天苷和內標保留時間分別為1.52 和1.98 min。在空白血漿中，沒有發現內源性物質干擾紅景天苷的分析。

3.1.2 提取回收率試驗

于空白大鼠血漿中加入對照品溶液配制成（5、50、200 ng/ml）3 種濃度的對照品血漿溶液，每個濃度平行為6 份，按“血漿預處理方法”項處理，進樣，測定峰面積A1。另取6 份空白大鼠血漿，按“血漿預處理方法”項處理后，加入按對照品溶液配制成（5、50、200 ng/ml）3 種濃度的對照品血漿溶液，每個濃度平行為6 份，進樣，測定峰面積A2。計算A1/A2為提取回收率，分別為（87.2±6.2）%、（85.1±4.4）%、（90.4±7.1）%。內標葛根素的提取回收率為（91.2±5.9）%。結果表明紅景天苷的提取回收率較高，且穩定。

圖2 紅景天苷在血漿中的LC/MS/MS 圖

3.1.3 精密度與準確性試驗

制備高、中、低濃度的質控樣品，按“2.4”項下方法提取后進樣分析。在3 d 內測定日內精密度，通過準備各濃度下6 份重復樣本來評估日間精密度。從標準曲線計算出質控樣品濃度，并對質控樣品結果進行方差分析以獲得精確度和準確性。結果見表1。幾組樣本的標準偏差和相對誤差均在合理范圍內，表明紅景天苷的精密度和準確性良好。

3.1.4 線性關系考察

取空白大鼠血漿適量，配成含紅景天苷4、5、10、20、50、100、200、500 ng/ml 的標準空白血漿系列溶液。按“2.4”項下提取，每個濃度平行測定6 份樣本。以待測物紅景天苷濃度為橫坐標，待測物與內標葛根素峰面積的比值為縱坐標，進行線性回歸，權重系數為1/C2，計算直線回歸方程。紅景天苷標準曲線為：Y=0.039 5X-0.013 1。其中，X 為紅景天苷的濃度（ng/ml），Y 為紅景天苷和內標質譜峰面積的比值。線性范圍為4～500 ng/ml，紅景天苷定量限為4 ng/ml。

3.1.5 穩定性試驗

分別取低、中、高3 個濃度的質控樣本各6 份，測定反復凍融3 次、-20 ℃存放2 周、室溫（20 ℃）下存放4 h、自動進樣器（4 ℃）保存24 h 后藥物的濃度，考察凍融和存放時間對紅景天苷穩定性的影響，試驗結果表明：紅景天苷在上述條件下穩定，不影響測定結果。結果見表2。

表2 紅景天苷在大鼠血漿中的穩定性(n=6)

3.2 藥動學試驗

該方法用于大鼠口服紅景天苷單體和坤復康片的藥動學研究。圖3 和表3 給出了通過DAS 2.0 計算兩組大鼠的平均濃度-時間曲線及其藥動學參數的數據。濃度-時間曲線見圖3。與紅景天苷單體組相比，坤復康片組中cmax、AUC0-t和AUC0-∞的水平顯著增加。

4 討論

圖3 大鼠灌胃紅景天苷單體和坤復康混懸液后紅景天苷血藥濃度均值-時間曲線（n=6）

表3 紅景天苷大鼠體內藥動學參數( ±s, n=6)

表3 紅景天苷大鼠體內藥動學參數( ±s, n=6)

*P ＜0.05，** P ＜0.01，與紅景天苷單體組比較。

參數 紅景天苷單體組 坤復康片組t1/2 (t/h) 36.08±6.63 27.44±9.87 MRT (t/h) 16.11±0.82 15.97±0.61 CL[L/(kg·h)] 0.022±0.003 0.016±0.003 cmax (ng/ml) 85.81±15.66 143.86±46.91*AUC0-t (ng·h/ml) 587.11±35.02 956.35±47.65**AUC0-∞ (ng·h/ml) 917.61±121.43 1 296.47±249.32*tmax (t/h) 0.50±0.00 0.83±0.47

本實驗建立了新的血漿中紅景天苷的LC/MS/MS 測定方法，方法簡單方便易行，分離效率好，專屬性強，血漿中雜質或內源性物質對待測物均不產生干擾，保留時間短、靈敏、穩定可靠，適用于針對紅景天苷大鼠血漿樣本的批量檢測。

實驗結果顯示，給大鼠分別予紅景天苷單體和坤復康片灌胃后，紅景天苷的一些藥動學特征，如t1/2、MRT 在兩組中未見差異，說明復方中其他成分可能對紅景天苷的體內消除過程影響較小。另一方面，部分藥動學參數顯示出顯著差異，主要表現為兩組AUC0-t、AUC0-∞、cmax均有顯著差異，表明復方給藥增加了紅景天苷吸收入體內的血藥濃度和體內暴露量，提示該復方成分對紅景天苷有增加吸收的作用。該結果證明了方劑配伍可明顯影響彼此在體內化學成分的藥動學參數，說明在中醫辨證理論指導下的復方配伍原則具有豐富的科學內涵。

根據文獻[11]報道，除紅景天苷外，坤復康片主要還包括氧化苦參堿、苦參堿、芍藥內酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷等若干種成分，復方中幾味藥材間存在復雜的相互作用，從而可能導致藥效發生改變，值得我們進一步深入研究。