阿司匹林聯合阿托伐他汀協同抑制非小細胞肺癌細胞增殖及其機制研究

俞 俊，段晶晶，張 曄 （上海市奉賢區中心醫院藥劑科，上海 201499）

非 小 細 胞 肺 癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常見的組織學類型，發病率逐年增高，無論是在我國還是全球，都已成為致死率最高的癌癥之一[1]。因此，對于NSCLC 的防治，特別是探索新的化學預防策略顯得尤為重要。目前新興出現的以靶向和免疫療法為手段治療NSCLC越來越引人關注，盡管如此，對于肺癌的治療同樣也面臨著研發新型抗癌藥物的挑戰，包括研發過程中所需巨額費用和時間，而重新使用具有潛在癌癥治療的非抗癌藥物用于癌癥治療，不僅可以節省研發新藥所需的人、財、物力，甚至還可能提高治療效果。臨床前研究和數據證實許多非抗癌藥物具有潛在的預防和治療癌癥的作用，譬如對NSCLC的預防和治療，這些藥物就有阿司匹林、他汀類藥物等[2]。

阿司匹林和阿托伐他汀是廣泛用于心血管疾病的一線防治用藥。近年來，它們已經被證實可能成為新興的、可用于不同類型腫瘤（包括NSCLC）的化學預防藥物[3-5]。盡管它們抗NSCLC 的確切分子機制尚需要進一步研究，但文獻報道其抗腫瘤作用機制存在重疊，即均可靶向作用于mTOR 和NFκB 通路。據此我們假設：阿司匹林和阿托伐他汀聯合使用可通過共同抑制mTOR 和NFκB 通路而發揮協同抗NSCLC 效應。為驗證假設，本實驗選取了非小細胞肺癌A549 和NCI-H460 細胞，在體外研究阿司匹林聯合阿托伐他汀對它們細胞增殖的影響及其相關作用機制，期望在應用阿司匹林和阿托伐他汀防治心血管疾病的同時可以降低NSCLC 的患病風險，以及為設計新型控制NSCLC的干預策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌A549 和NCI-H460 細胞（美國Manassas 公司），培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基（美國Sigma-Aldrich 公司），置37 ℃飽和濕度、5% CO2培養箱孵育。阿司匹林和阿托伐他汀標準品化合物（美國Sigma-Aldrich 公司），用DMSO 溶解后-20 ℃保存。RNA 提取試劑盒購自上海博彩生物科技公司，BCA 法蛋白定量試劑盒和TNF-α 和IL-1β 反轉錄試劑盒購自美國Thermo scientific 公司，SYBR qPCR 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。mTOR、p-mTOR、NFκB、p-NFκB、Bcl-2、Mcl-1、β-Actin 抗體以及鼠、兔二抗購自美國CellSignal 公司。其他試劑以及儀器設備由本實驗室提供。

1.2 MTS 法檢測細胞增殖活性

分別取對數生長期非小細胞肺癌A549 和NCIH460 細胞，用胰酶-EDTA 消化并計數，將100 μl的細胞混懸液接種于96 孔培養板使每孔的細胞數約為5×103個/100 μl。待24 h 后細胞貼壁，加入阿司匹林或/和阿托伐他汀（先用DMSO 溶解再用DMEM培養液稀釋成不同濃度）。使與細胞作用的阿司匹林濃度分別為0、5、50、100、150、200 μmol/L，阿托伐他汀濃度分別為0、1、2、5、10、20 μmol/L。每個濃度設3 個復孔，對照組加入DMEM 培養液。置于37 ℃、5% CO2培養箱72 h 后，加入10 μl MTS 溶液（臨用前用PBS 溶解，pH7.4,質量濃度為5 g/L），再置培養箱繼續培養1 h，于酶標儀490 nm處檢測吸光度值（A 值）。

細胞增殖存活率（%）=（實驗孔A 值/對照孔A 值）×100。

1.3 細胞劃痕實驗

分別將A549 和NCI-H460 細胞懸液接種于兩個6 孔培養板中，保證每孔細胞數約為1×105個/孔，次日待細胞貼壁鋪滿后進行劃痕，PBS 清洗一遍后更換無血清培養液。根據MTS 實驗結果選取了濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯合作為處理藥物，共設3 個給藥組和1 個對照組進行實驗，24 h 后觀察劃痕距離變化并在顯微鏡下拍照，與給藥前進行比較。

1.4 Western blotting 檢測蛋白表達

以1×105個/孔接種NCI-H460 細胞于6 孔板中，同樣設置有濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者聯合的3 個藥物處理組和1 個對照組，并給予對應濃度的藥物處理細胞，對照組不作處理。繼續培養72 h 后收集細胞，PBS 洗細胞3 次，加入細胞裂解液（含20 mmol/L Tris-Hcl/pH 7.5、1% Triton、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L 無水焦硫酸鈉、1 mmol/L β-甘油磷酸鹽、1 μg/ml 亮肽素和1 mmol/LPMSF），用細胞刮刀將細胞刮下，4 ℃冰浴中超聲破碎細胞，待細胞膜破碎反復渦旋后，于4 ℃、12 000 r/min 離心，取上清，BCA 法蛋白定量后樣品經SDS-PAGE 分離，蛋白電轉至PVDF 膜，將PVDF 膜在5%牛奶中封閉1 h，加入1∶1 000 的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，加入酶標二抗室溫1 h，PVDF 膜經ECL 化學發光底物檢測蛋白。

1.5 實時定量PCR 分析（qRT-PCR）實驗

以1×105個/孔接種NCI-H460 細胞于6 孔板中，設置有濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者聯合的3 個藥物處理組和1 個對照組。次日待細胞貼壁換培養液給予對應濃度的藥物處理細胞，對照組不作處理，繼續培養72 h后收集細胞。采用RNA 提取試劑盒（上海博彩）提取細胞總RNA，按照TNF-α 和IL-1β 反轉錄試劑盒說明書（美國Thermo scientific 公司）操作進行反轉錄。得到的cDNA 按照SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說明書進行實時定量PCR 檢測。每個PCR 反應體系包括：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、cDNA 模板2 μl、10 μmol/L 上下引物（表1）各0.4 μl 以及7.2 μl 去離子水，總反應體積為20 μl，經7300 qRT-PCR 系統（Applied Biosystems）檢測，反應循環參數為95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s 共40 個循環。基因的表達用ΔΔCt 法計算，以β-actin 作為內參。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.6 統計處理

使用SPSS 16.0 軟件進行數據處理，所有數據以（±s）表示，采用t 檢驗進行兩組間差異比較，P＜0.05 為顯著差異。

2 結果

2.1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對A549和NCI-H460 細胞增殖的影響

我們選取了濃度分別為0、5、50、100、150、200 μmol/L 的阿司匹林和0、1、2、5、10、20 μmol/L的阿托伐他汀處理A549 和NCI-H460 細胞，72 h后采用MTS 法測定兩種細胞的增殖活性，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制曲線（圖1）。結果顯示：阿司匹林和阿托伐他汀單用（濃度分別≥100 和5 μmol/L）或二者聯用均能明顯抑制A549 和NCI-H460 細胞增殖，且二者聯用抑制作用大于單用。例如，100 μmol/L 阿司匹林和5 μmol/L 阿托伐他汀，以及二者聯用處理A549 細胞，72 h 后存活率（與對照孔比較）分別為(69.64±5.95)%、(59.31±5.66)%和(39.51±13.22)%，聯合與單用比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。同樣相同濃度的阿司匹林和阿托伐他汀以及二者聯用處理NCI-H460 細胞，72 h 后與存活率（與對照孔比較）分別為(76.73±11.30)%、(59.13±6.61)%和(36.82±8.15)%，且聯合與單用比較，差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對A549 和NCIH460 細胞增殖的影響

2.2 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對A549和NCI-H460 細胞遷移與侵襲的影響

根據MTS 實驗結果，選取了濃度為100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯合作為處理藥物，共設3 個給藥組和1 個對照組進行實驗，24 h 后觀察劃痕距離變化并在顯微鏡下拍照（圖2）。結果顯示：與給藥前比較，阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合均較明顯抑制了兩種細胞的遷移與侵襲，且二者聯合的抑制作用顯著增強。

圖2 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對A549 和NCIH460 細胞遷移與侵襲的影響

2.3 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對NCIH460 細胞信號調控因子相關蛋白表達的影響

選取濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者聯合作為處理藥物，共設3 個給藥組和1 個對照組處理NCI-H460 細胞，72 h 后收集細胞。細胞裂解提取蛋白并采用BCA 法測定總蛋白，采用Western blotting 法檢測相關蛋白的表達，結果如圖3。

結果顯示：100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯合均可以抑制p-NFκB、pmTOR 以及抗凋亡因子Mcl-1 和Bcl-2 的蛋白表達，且與單藥相比，二者聯合抑制效應增強，表明阿司匹林和阿托伐他汀聯合可以產生協同抑制作用。但與對照組比較，給藥組對總NFκB 和總mTOR 的蛋白表達均無明顯影響。

圖3 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對NCI-H460 細胞信號調控因子蛋白表達的影響

2.4 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對NCIH460 細胞TNF-α 和IL-1β mRNA 表達的影響

同 樣，選 取 濃 度 為100 μmol/L 阿 司 匹 林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯合作為處理藥物，共設3 個給藥組和1 個對照組處理NCI-H460 細胞，72 h 后收集細胞。提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作對TNF-α 和IL-1β 進行實時定量PCR 檢測，結果如圖4。

圖4 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯合對NCI-H460 細胞TNF-α 和IL-1β mRNA 表達的影響

結果顯示：與對照組比較，阿司匹林組、阿托伐他汀組以及二者聯合處理組NCI-H460 細胞中TNF-α 表達量分別是對照組的（1.13±0.25）、（0.89±0.06）和（0.79±0.23）倍，IL-1β 表達量分別是對照組的（0.94±0.20）、（0.81±0.36）和（0.52±0.24）倍。其中，阿托伐他汀組TNF-α 和聯合處理組IL-1β 的表達，與對照組比較差異存在統計學意義（P＜0.05），尤其是聯合處理組IL-1β 的表達差異最為明顯，與對照組比較下降了近50%。

3 討論

流行病學數據顯示，服用阿司匹林或者阿托伐他汀的人群出現了肺癌患病率降低或者腫瘤發生發展的延緩。譬如，Van Dyke 等[6]發現成人加強劑量的阿司匹林可以降低55～64 歲婦女罹患NSCLC 的概率；Jiang 等[7]報道，標準劑量阿司匹林（＞325 mg）服用5 年以上降低了肺癌事件的發生。Lin 等[8]在采用傾向評分法對5 118 名65 歲以上的Ⅳ期NSCLC 患者的臨床研究發現，服用了阿托伐他汀平均生存時間提高了3 個月，并且得出結論阿托伐他汀提高了Ⅳ期NSCLC 患者的存活率。這些報道均提示阿司匹林和阿托伐他汀對肺癌具有直接的抑制效應，然而兩藥聯合使用時是否可以表現出協同抗癌活性，目前報道較少，He 等[9]研究顯示阿司匹林和阿托伐他汀對前列腺癌細胞的增殖有聯合抑制作用，但對肺癌細胞的作用未見報道。據此，我們選取了非小細胞肺癌A549 和NCI-H460 細胞，在體外研究阿司匹林聯合阿托伐他汀對它們的抑制效應及其相關作用機制。

首先，我們采用MTS 法檢測了阿司匹林和阿托伐他汀單用及聯合對A549 和NCI-H460 細胞增殖的影響，結果顯示（圖1）：當阿司匹林和阿托伐他汀的濃度分別大于100 和5 μmol/L 時均能明顯抑制A549 和NCI-H460 細胞增殖，且二者聯用抑制作用明顯大于各自單用。他汀類藥物在體內外可以抑制癌細胞（包括NSCLC）的增殖已有文獻報道[10-12]，該結果與之相符。但阿司匹林在體外抑制NSCLC 細胞的增殖，以及聯合阿托伐他汀發揮協同抑制作用，文獻未見報道。所以，本實驗結果提示阿司匹林聯合阿托伐他汀可以發揮協同抑制NSCLC 細胞增殖效應。其次，我們在細胞劃痕實驗中觀察到100 μmol/L 阿司匹林和5 μmol/L 阿托伐他汀均能抑制A549 和NCI-H460 細胞的遷移與侵襲，且二者聯合抑制作用顯著增強（圖2），該結果也進一步說明阿司匹林聯合阿托伐他汀發揮協同抑制NSCLC 細胞效應。

阿司匹林和他汀類藥物在臨床上廣泛應用于預防和治療心血管疾病，但近年來由于其抗炎作用、抗腫瘤活性的研究發現，且其分子機制研究已經比較成熟，已經無可爭議的成為癌癥預防的候選藥物。通過文獻綜述我們發現，阿司匹林和他汀類藥物發揮抗腫瘤的分子機制有重疊，即均可以直接或間接作用于mTOR 和NFκB 信號靶點[4,13]，影響它們通路下游一些基因和蛋白的表達，進而發揮抑制癌細胞增殖、誘導凋亡、抗血管生成以及轉移等一系列抗腫瘤活性。本研究我們在NCI-H460 細胞中驗證了阿司匹林和阿托伐他汀靶向作用于mTOR 和NFκB 信號靶點，抑制它們的磷酸化過程（即抑制活化），且能夠抑制它們信號轉導下游抗凋亡基因Mcl-1 和Bcl-2 的蛋白表達。同時還發現當阿司匹林和阿托伐他汀聯合應用時，對這些信號通路中這些蛋白的表達下調作用更加明顯，提示二者聯合發揮了協同作用（圖3）。另外，文獻報道他汀類藥物可以通過作用炎癥調控因子NFκB 影響細胞內一些重要炎癥因子（如TNF-α、IL-8 等）的生成[14-15]，同樣，我們在研究中也發現阿托伐他汀降低了NCI-H460 細胞中炎癥因子TNF-α 的mRNA表達，對IL-1β 的mRNA 表達也有抑制作用但差異沒有統計學意義（與對照組比較P＞0.05，圖4），阿司匹林未發現有相同的作用，但二者聯合顯著降低了IL-1β 的mRNA 水平，與對照組比較下降近50%。此結果提示阿司匹林和阿托伐他汀聯合應用可能對某些促炎因子（如IL-1β）的影響有協同作用。

綜上所述，阿司匹林聯合阿托伐他汀可以協同抑制非小細胞肺癌A549 和NCI-H460 細胞的增殖，其機制為共同作用于mTOR 和NFκB 信號靶點并且影響該靶點信號轉導下游調控基因的表達，如抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-2 以及炎癥因子TNF-α 和IL-1β（圖5），但這種協同作用是如何通過作用mTOR 和NFκB 并調控其下游目的基因來實現的，以及是否還通過作用于新的信號靶點或者其他信號通路（圖5 路線③）發揮協同抑制作用有待于進一步研究求證。

圖5 阿司匹林聯合阿托伐他汀抑制NSCLC 分子機制