白術黃連微丸結腸靶向膠囊的制備及體外釋放研究

唐曉萌，駱錦前，汪五清，顧永衛，劉繼勇, （. 海軍軍醫大學附屬長海醫院藥學部，上海 004；. 復旦大學附屬閔行中心醫院皮膚科，上海 099；. 復旦大學附屬腫瘤醫院藥劑科，上海 000）

微丸是指直徑小于2.5 mm(或0.5～1.5 mm)的球形或類球形固體劑型[1]。相比傳統的中藥水煎劑和化學藥片劑，微丸具有能夠提高藥物與胃腸道的接觸面積，增加藥物的生物利用度；載藥范圍寬，流動性好，體積小等特點；且單個微丸的缺陷不影響制劑的整體釋放效果，尤其適用于復方制劑的配伍，同時能夠提高藥物的穩定性[2-4]。

潰瘍性結腸炎（UC）是一種常見的自身免疫性疾病[5]。傳統的UC 治療藥物包括腎上腺皮質激素類（如潑尼松）、氨基水楊酸類（如美沙拉嗪）和免疫抑制劑類（如硫唑嘌呤）等，上述藥物針對輕重度患者均有較好的治療效果，但只能緩解癥狀，且長期應用副作用較大[6-7]。中醫藥在治療潰瘍性結腸炎方面獨具優勢，但劑型的落后、給藥方式的局限在很大程度上影響了中藥療效的發揮[8-9]。本研究選擇中藥臨床驗方“白術黃連方[10]”為模型方劑，根據其組方特點和藥物成分特性，以膜控型包衣微丸為給藥載體，將其處方中的藥物分別制備成“胃溶微丸”和“腸溶微丸”，進一步組合成結腸靶向給藥膠囊，以期為臨床潰瘍性結腸炎的治療提供一種新的有效制劑，同時為復方中藥新藥開發提供方法學借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

101A-2 型干燥箱（上海實驗儀器總廠）；AG285十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB100D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；5804R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；FlexStream? MP1 流化床、NICA? E140 擠出機、NICA? S450 滾圓機（德國基伊埃技術設備有限公司）；RCZ-6C3 型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器廠）。

1.2 試藥

白術揮發油（批號：XC20170225）、黃連提取物（批號：XC20170113）、防風提取物（批號：XC20170216）購自西安小草植物科技有限公司；鹽酸小檗堿對照品（按含C20H18ClNO4計為86.7%，批號：5UVU-ZFW7）購自中國食品藥品檢定研究院；β-環糊精（β-CD，曲阜市天利藥用輔料有限公司，批號：161202）；微晶纖維素（MCC，湖州市菱湖新望化學有限公司，批號：P101D0516N09）；無水乳糖（ DMV-Fonterra Excipients GmbH & Co.KG，Germany，批號：10147P9）；交聯聚維酮（PVPP XL-10， 上 海 源 葉 生 物 科 技 有 限 公 司， 批 號：B22A7S19749）；丙烯酸樹脂EUDRAGIT?L30D-55（以下簡稱L30，批號：B170314162）、丙烯酸樹脂EUDRAGIT?FS30D（以 下 簡 稱FS30，批 號：C170265001）購自Evonic Rolm GmbH 公司；羥丙甲基纖維素（HPMC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：K1717099）；檸檬酸三乙酯（TEC，上海昌為醫藥輔料技術有限公司，批號：170712）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿HPLC 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（0.5%三乙胺，磷酸調至pH=3）等度洗脫，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外檢測波長345 nm，柱溫25 ℃，進樣量20 μl。

2.1.2 方法學考察

精密稱取鹽酸小檗堿對照品1.0 mg，用甲醇溶解定容于10 ml 容量瓶中作為儲備液，將此儲備液用甲醇逐級稀釋成系列對照品溶液，進樣測定。取少量腸溶微丸研碎，稱取一定量粉末，加入甲醇，超聲提取30 min，3 000 r/min 離心后取上清，定容后過0.45 μm 濾膜得到供試品溶液。同法制備空白輔料溶液。方法學考察表明，鹽酸小檗堿在（0.05～50.00）μg/ml 濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=100 513X-5 262.7（r=0.999 9）。甲醇、空白輔料對腸溶微丸中鹽酸小檗堿的含量測定沒有干擾，專屬性良好（圖1）。取濃度為10.0、20.0和50.0 μg/ml 的鹽酸小檗堿對照品溶液連續進樣6 次，連續測定3 d，記錄色譜圖峰面積，得到3 個濃度的鹽酸小檗堿的日內精密度結果分別為0.19%、0.42%、1.52%，日間精密度分別為0.58%、1.43%、1.28%。稱取適量黃連提取物，分別加入濃度為10.0、20.0、50.0 μg/ml 的鹽酸小檗堿對照品溶液，超聲提取30 min，3000 r/min 離心后取上清液，定容后過0.45 μm 濾膜，進樣測定，記錄色譜圖峰面積，加樣回收率RSD 分別為0.85%、1.90%、0.60%，表明該方法可用于腸溶微丸中鹽酸小檗堿的含量測定。

圖1 鹽酸小檗堿的HPLC 圖

2.2 腸溶微丸的制備

2.2.1 丸芯處方單因素篩選

載藥量、填充劑比例、潤濕劑和黏合劑的用量對微丸的成型起到至關重要的作用。因此，我們采用單因素篩選的方法對上述4 個因素進行了考察，評價的指標分別為微丸的圓整度、目標微丸的收率和物料黏性。

根據處方，黃連提取物與防風提取物的比例為15∶12。固定MCC：乳糖=5∶2，PVPP 用量5%，水為潤濕劑，6% HPMC 為黏合劑。考察載藥量對微丸圓整度、收率及物料黏性的影響，結果見表1。

表1 載藥量對微丸特性的影響

同樣采用單因素篩選的方法分別對填充劑比例、潤濕劑用量和黏合劑用量進行了考察。固定載藥量為27%，以水為潤濕劑，PVPP 用量為5%，6%HPMC 為黏合劑，考察MCC 與乳糖之比對微丸圓整度、收率及物料黏性的影響；固定載藥量為27%，PVPP 用量5%，6% HPMC 為黏合劑，考察潤濕劑的用量對微丸圓整度、收率及物料黏性的影響；固定載藥量為27%，PVPP 用量5%，水為潤濕劑，考察黏合劑6% HPMC 的用量對微丸圓整度、收率及物料黏性的影響。

根據單因素實驗的結果，綜合考慮微丸圓整度、收率和物料黏性等因素，最終確定優化后的丸芯處方為：載藥量27%，PVPP 5%，MCC 與乳糖之比5∶2，潤濕劑占干物料比重30%，黏合劑占干物料比重20%，并以此條件制備3 批丸芯進行驗證試驗，結果表明處方配比合理。

2.2.2 工藝參數的優化

選取擠出速度、滾圓速度和滾圓時間進行三因素三水平正交實驗，對工藝參數進行優化。按照表2 分組進行微丸的制備，每組按投入干物料100 g進行實驗。計算目標微丸收率Y（%，18～30 目）和微丸圓整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）作為評價指標。

表2 L9(34)正交試驗設計與結果

結果表明，3 個因素對綜合評分的影響順序為B＞A＞C，表3 方差分析結果表明，3 個因素對綜合評分并無顯著影響(P＞0.05)。考慮到實際實驗過程中較大的滾圓速度有利于減少微丸細粉的產生并提高生產效率，最終確定優化后的工藝參數為A1B2C3，即擠出速度20 Hz，滾圓速度700 r/min，滾圓時間7 min。

表3 方差分析結果

2.2.3 隔離衣的包制

藥物在溶出時，完整的包衣膜決定了微丸內部和介質之間存在一定的滲透壓差。丸芯內外壓差對藥物的釋放影響作用較大，因此，在處方篩選過程中，必須考察丸芯的隔離情況[11]。包制隔離衣后，也使后續包制的腸溶衣膜厚度更加均勻，保證了包衣過程的連續性。固定丸芯原輔料比例不變，分別考察了隔離衣增重為2%、4%、6%和8%時腸溶微丸中鹽酸小檗堿的釋放情況，累積釋放曲線如圖2A。結果表明隔離衣增重對累積釋放度的影響不顯著，最終采用4%的HPMC 溶液進行隔離衣的包制，包衣增重為丸芯重量的2%。

圖2 對腸溶微丸累積釋放度產生影響的幾種因素

2.2.4 腸溶衣的包制

聚合物比例、增塑劑用量和包衣增重是調節膜控型微丸釋藥速率的3 個關鍵因素。因此，同樣采用單因素篩選的方法對上述3 個因素進行考察，并繪制不同參數下的累積釋放曲線。

固定微丸的隔離衣增重為2%，腸溶衣增重為15%，考察聚合物不同比例對鹽酸小檗堿累積釋放度的影響，累積釋放曲線如圖2B 所示，結果表明，當L30 與FS30 之比為1∶2，符合對累積釋放度設定的標準。

固定L30 與FS30 之比為1∶2，包衣增重為15%，考察增塑劑用量占干聚物比例為5%、10%、15%、20%和25%時對微丸中鹽酸小檗堿累積釋放度的影響。圖2C 結果表明，當增塑劑用量為10%～25%時，藥物釋放基本滿足給定的標準，但實際操作中發現增塑劑用量變大時，微丸包衣難度加大，易產生粘連現象。最終將增塑劑用量定為10%，既能滿足釋放要求，又能保證較高的生產效率。

最后對包衣增重進行篩選，固定L30 與FS30之比為1∶2，考察包衣增重為5%、10%、15%和20%時對微丸中鹽酸小檗堿累積釋放度的影響，結果如圖2D 所示，當包衣增重為15%時，滿足對累積釋放度設定的標準。

根據單因素篩選的結果，最終確定包衣處方為：隔離衣增重2%，L30 與FS30 之比為1∶2，增塑劑用量10%，包衣增重為15%。按此處方制備3 批微丸進行驗證試驗，工藝參數如下：噴嘴直徑1 mm，輸液管直徑3 mm，霧化壓力1.8 bar，蠕動泵轉速2.5 r/min，進風溫度32 ℃，進風量50 cm2，干燥溫度28 ℃，干燥時間30 min。結果表明，據此條件制備的腸溶微丸滿足對累積釋放度設定的標準。

2.3 胃溶微丸的制備

2.3.1 白術揮發油β-CD 包合物的制備

采用飽和水溶液法制備包合物。稱取規定量的β-CD 加入10 倍蒸餾水，置于70 ℃的恒溫水浴鍋中，攪拌使成飽和溶液。在30 ℃下邊攪拌邊緩慢滴加一定量（揮發油與β-CD 之比為1∶6）白術揮發油（用無水乙醇預先配置成1∶1 的溶液），恒溫攪拌1.5 h，冷卻至室溫，在4 ℃冰箱中冷藏24 h，抽濾后用無水乙醇沖洗3 次（每次10 ml），40 ℃干燥4～5 h 即得白術揮發油β-CD 包合物[12]。

2.3.2 丸芯處方的單因素考察

參照腸溶微丸的處方篩選過程，對胃溶微丸的處方同樣進行單因素篩選。實驗過程中發現，包合物由于粉末較為細膩，在與微晶纖維素和乳糖混合后，僅需加入少量水作為潤濕劑就可以得到塑性良好的濕物料，且易于擠出-滾圓成丸，因此，胃溶微丸的處方中不再添加黏合劑。僅對載藥量、填充劑比例和潤濕劑用量進行考察。經單因素實驗篩選后最終確定優化后胃溶微丸的丸芯處方為：載藥量50%，PVPP5%，微晶纖維素與乳糖之比2∶1，潤濕劑占干物料比重40%，并以此條件制備3 批丸芯進行驗證試驗，結果表明處方可行。

2.3.3 擠出滾圓工藝參數的優化

同樣選取擠出速度、滾圓速度和滾圓時間進行三因素三水平正交試驗對工藝參數進行優化。按照表4 分組進行微丸的制備，每組按投入干物料100 g 進行實驗。計算目標微丸收率Y（%，16～24 目）和微丸圓整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）為評價指標。

表4 L9(34)正交試驗設計與結果

實驗結果表明，3 個因素對綜合評分的影響順序為B＞C＞A，方差分析結果（表5）表明，3 個因素對綜合評分并無顯著性影響(P＞0.05)?？紤]到簡化制備過程以降低成本，最終確定優化后的工藝參數為A1B1C2，即擠出速度20 Hz，滾圓速度500 r/min，滾圓時間5 min。

表5 方差分析結果

2.3.4 胃溶衣的包制

配制濃度為4%的HPMC 溶液，流化床底噴包衣進行胃溶衣的包制，包衣增重為2%。包衣參數如下：噴嘴直徑1 mm，輸液管內徑3 mm，霧化壓力1.5 bar，蠕動泵轉速2.5 r/min，進風口溫度45 ℃，進風量50 m3/h，干燥溫度40 ℃，干燥時間30 min。

將胃溶微丸與腸溶微丸按照質量比1∶1 的比例裝入0 號硬質膠囊，得到白術黃連微丸口服結腸靶向膠囊。

2.4 體外釋放度的測定

按照《中國藥典》2015 版四部通則0931 溶出度與釋放度測定法第二法：槳法，評價腸溶微丸的釋藥特性。溶出介質體積為750 ml，轉速100 r/min，溫度（37±0.5）℃。分別在pH 1.2 的人工胃液中釋放2 h，pH 6.8 的人工小腸液中釋放4 h，pH7.6 的人工結腸液中釋放18 h，溶出介質體積均滿足漏槽條件。分別于1～14 h 之間每1 h 一次，14～24 h 之間每2 h 一次，定時取樣1 ml，隨后立即補加同溫同體積介質1 ml，將收集的樣品過0.45 μm 濾膜后按照“2.1.1”項下方法進樣測定，計算體外累積釋放度，釋放曲線如圖3 所示。結果表明，按照最優處方制備出的腸溶微丸在人工胃液中2 h 基本不釋放，人工小腸液中4 h 累積釋放量小于10%，人工結腸液中緩慢釋放，24 h 基本釋放完全，兼具緩釋和結腸靶向的特性。

圖3 鹽酸小檗堿的體外累積釋放度( ±s，n=6)

2.5 腸溶微丸釋藥行為考察

將腸溶微丸的釋藥曲線分別按零級、一級和Higuchi 方程進行擬合[13]，得到的結果如表6 所示。結果表明，其釋放行為符合Higuchi 方程釋藥模型（r=0.9054）。

表6 腸溶微丸不同釋藥行為的擬合方程

3 討論

本研究首先將處方中黃連的有效成分黃連生物堿和防風的有效成分色原酮、多糖等采用L30與FS30 混合包衣，制備腸溶微丸；再將白術的有效部位——揮發油類成分通過環糊精包合成揮發油β-CD 包合物，制備成胃溶微丸；然后將兩種微丸按比例混合裝入膠囊，得到口服結腸靶向膠囊。藥物口服后，能夠發揮“兩步釋放”的效果，白術的有效成分首先在胃內釋放；黃連生物堿和防風色原酮等成分在結腸部位緩慢釋放，二者合一，體現了中醫藥整體與局部相結合的治法治則[14]。

腸溶微丸的制備采用擠出-滾圓工藝和流化床包衣技術，工藝穩定性和重現性好，適用于工業化大生產。腸溶微丸中藥物的釋放主要通過膜控來實現，而高分子材料丙烯酸樹脂L30 和FS30 分別在pH＞5.5 和pH＞7.0 環境中溶解。因此，可通過混合并調節兩者的用量，獲得在小腸末端開始釋放，到達結腸后大量釋放的混合材料，起到緩釋和結腸定位的雙重作用。同時，本研究使用混合材料進行單層衣膜的包制，簡化了包衣步驟，降低了多層包衣造成的成本損耗。依據本實驗處方工藝連續制備3 批腸溶微丸，釋放度結果顯示該3 批微丸均具有良好的緩釋效果，且批間差異小，表明本處方工藝合理，簡單易行，重現性良好，適用于工業化生產。

經口服進入胃內的藥物在2～4 h 后基本會全部通過，隨后進入小腸繼續吸收，這一過程需要5～6 h，最后進入結腸被進一步重吸收，12～24 h后才會排出體外[15]。因此，將微丸中鹽酸小檗堿的釋放度標準定為，在pH1.2 的人工胃液中2 h 基本無釋放（＜5%），pH6.8 的人工小腸液中4 h 累積釋放度＜10%，pH7.8 的人工結腸液中6 h 累積釋放度＞60%。聚合物比例決定了腸溶衣膜溶解的速率，進而影響藥物的釋放度。適量增塑劑的加入可降低玻璃化溫度和最低成膜溫度，有助于提高包衣膜的完整性，檸檬酸三乙酯類的增塑劑還能夠增加包衣膜的柔性。通過對包衣增重的調整，也可以使藥物的釋放度符合預期的設計。

將白術揮發油包合后，能夠有效掩蓋藥物的不良氣味，同時增加有效成分的穩定性，實現了液體藥物向固體制劑的轉化。胃溶微丸在口服后，表面衣膜與介質接觸后不斷溶脹，由于溶脹層較薄，丸芯中的MCC 和乳糖吸水后大幅膨脹導致微丸迅速崩解成細顆粒，溶出介質將包合物溶解后形成濃度差，促進了藥物的擴散釋放，有利于藥物迅速吸收入血，發揮全身作用。