煙酰胺單核苷酸對小鼠潰瘍性結腸炎的作用

張賽龍，凌期盛，楊 政，繆朝玉 （. 海軍軍醫大學藥學院藥理學教研室，上海 00433；. 煙臺大學藥學院，山東煙臺 64005）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是真核細胞中的一種重要的代謝氧化還原輔酶，它在各種生物過程中起關鍵作用，包括新陳代謝、衰老、細胞死亡、DNA 修復和表達[1-2]。NAD 主要有3 種生物合成途徑，在哺乳動物中，補救途徑是NAD 的主要來源并且該途徑只有兩個步驟（圖1）。NAD 在該途徑中的合成速率主要由煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（Nampt）決定，該步驟首先將煙酰胺（NAM）和5-磷酸核糖基-1-焦磷酸（PRPP）轉化為煙酰胺單核苷酸（NMN）。然后，在第二步中將NMN 與ATP 偶聯并轉化為NAD[3]。直接使用NMN 可以彌補NAD 的不足，因此NMN 可以參與多種疾病的調節，如2 型糖尿病、肥胖癥、心力衰竭、神經再生和炎癥等[4-8]。

潰瘍性結腸炎是炎癥性腸病的一種。近年來，其病因和發病機制的研究受到廣泛關注[9-11]。目前治療潰瘍性結腸炎的手段主要是對癥治療，如抗感染藥、糖皮質激素和免疫抑制劑等，但這些藥物長期使用會帶來很多不良反應[12-13]。NAD 與多種炎癥性疾病有關，如敗血癥和類風濕性關節炎[14-15]。此外，有報道顯示，炎癥性腸病患者結腸組織和血清中Nampt 濃度升高，并將Nampt 作為小兒炎癥性腸病嚴重程度的標志物[16-17]。因此，作為NAD合成的中間重要產物NMN，也有可能對炎癥性腸病產生一定作用。與此同時，目前有很多含有NMN的保健品問世，但是由于NMN 參與調節的功能非常復雜，并且有研究表明NMN 可以促進腫瘤的增殖等作用[18]，因此，補充NMN 并不一定對人體都有益。并且，NMN 作為保健品需要長期服用，但對于一些患有如炎癥性腸病的慢性病患者，評價其對于患者的安全性極其重要。

本研究主要考察NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型的作用。以評價NMN 作為保健品是否適用于患有潰瘍性結腸炎的患者。

圖1 哺乳動物細胞中NAD 的生物合成途徑[4-8]

1 材料與方法

1.1 DSS 誘導腸炎模型的制備

雄性C57 小鼠（8 周齡，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司），放于實驗室適應2 周后進行造模。按照之前的方法進行模型制備[19]，將DSS（美國MP 公司，分子量為36 000～50 000）溶于水中，至終濃度為3%，讓小鼠自由飲用。

1.2 分組及給藥情況

將NMN[音芙醫藥科技（上海）有限公司]溶于生理鹽水中，制備不同濃度的NMN 溶液，將雄性C57 小鼠分為6 組，分別為生理鹽水對照組，3、10、30、100、300 mg/kg NMN 的不同劑量組。按照容積0.1 ml/10 g，通過灌胃（ig）和腹腔注射（ip）兩種方式，從第1 天開始給藥，每天1 次，直至實驗觀察結束。

1.3 疾病評分（DAI）

按照之前的評分標準進行評分[19]，對體重下降程度、大便性狀、血便情況分別進行評分，而后進行加和，計算總分數。具體評分標準見表1。

表1 疾病評分

1.4 形態學檢測及組織學染色

小鼠處死后，取整個結腸部位，測量長度進行比較。而后將結腸下段部位組織用4%多聚甲醛固定24 h，然后包埋在石蠟中。準備厚度為4 μm的切片，按照之前的實驗方法，進行HE 染色[19]。

1.5 統計分析

2 結果

2.1 NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠生存時間的影響

為了確定實驗的最佳觀察時間，首先對小鼠的生存曲線進行測定。將100 和300 mg/kg 的NMN通過灌胃的給藥方式，檢測3%DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠生存時間（圖2），在給藥第9 天時，300 mg/kg 組中有2 只小鼠死亡，生理鹽水對照組和100 mg/kg 組在第10 天出現小鼠死亡。第17 天時，300 mg/kg 組小鼠全部死亡，而在第20 天時，生理鹽水對照組和100 mg/kg 組全部死亡。3 組生存曲線之間并無統計學差異。由于在給藥第9 天時，有小鼠出現死亡，因此我們將后面實驗的觀察時間設定為8 d。

圖2 NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠生存曲線的影響（每組n = 10）

2.2 NMN 不同給藥方式對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠體重和DAI 的影響

為了考察不同給藥方式對小鼠的影響，我們分別通過灌胃和腹腔注射兩種給藥方式，觀察NMN對于小鼠體重和DAI 的影響，如圖3 所示，灌胃和腹腔注射兩種給藥方式對潰瘍性結腸炎模型小鼠體重和DAI 分數的影響無顯著性差異，二者都在第5 天時表現出體重下降并出現稀便情況。因此，為了更真實的模擬人用藥環境，我們在后續實驗中均采用灌胃的給藥方式。

圖3 NMN 不同給藥方式對于DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠體重和DAI 影響

2.3 NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠結腸長度與形態的影響

為了進一步考察不同濃度NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠的影響，我們應用了不同濃度的NMN 通過灌胃給藥的方式，分別對小鼠的體重和DAI 進行了檢測。結果顯示（圖4A、4B），不同濃度的NMN 對小鼠的體重和DAI 的影響，與對照組相比均無顯著性差異。為了更進一步確認，我們又對結腸長度和結腸形態進行了檢測，結果顯示（圖4C、4D），300 mg/kg 的NMN 與對照組相比，腸道長度和免疫組化切片結果并無顯著性差異。

3 討論

本研究測定了不同劑量的NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的體重、DAI 評分、結腸長度和腸道形態的影響，即NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠并無顯著作用。

NMN 作為NAD 的前體，其功能目前認為是通過NAD 來體現的，NNM 和NAD 的代謝是緊密聯系的。NAD 在人體內有3 條生化途徑：Preiss-Handler 途徑、從頭合成途徑和補救合成途徑（圖1）[20]。Preiss-Handler 途徑從NA 開始，經過NAPRT 催化變成NAMN，經過NMNAT 的催化，變成NAAD，然后再被NAD 合成酶NADS 催化成NAD[21]。從頭合成途徑首先是從食物中攝取的色氨酸開始，經過一系列體內生化反應生成喹啉酸（QA），而后經過（QPRT 催化生成NAMN 進入Preiss-Handler 途徑[22]。補救合成途徑從NAM 開始，然后經過NAMPT催化后，變成NMN，NMN 同樣通過NMNAT 酶的催化轉變成NAD，而后NAD 在經過3 個消耗途徑NAD 依賴的去乙酰化酶（Sirtuins）、多聚ADP核糖聚合酶（PARPs）、環腺苷二磷酸核糖（cADPR）合酶后變成煙酰胺完成循環[2]。NAD 的含量在這3 條途徑下保持平衡，補救合成途徑是人體NAD的主要來源，該過程中的NAMPT 是這個循環的限制步驟[23]。

NMN 作為NAD 合成的重要中間產物，存在于多種類型的細胞中，并參與了不同的生物學過程。NMN 可防止由NAD 分解代謝酶而引起的NAD 耗竭。目前報道的NMN 大部分作用對人體都是有益的，但是隨著研究的深入，NAD 的增加也能夠加重某些疾病的發展，如炎癥和腫瘤[18,24-25]。近期有研究表明，在克羅恩結腸炎和潰瘍性結腸炎患者的結腸組織中，血漿Nampt 和mRNA 水平均顯著升高[16]。更有研究表明，Nampt 的特異性抑制劑FK866，改善了DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠癥狀，并抑制了小鼠中與炎癥相關的腫瘤發生。由于Nampt 是NMN 的重要合成生物酶，因此,我們懷疑NMN 可能也會加重DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠癥狀。基于此，我們首先檢測了不同劑量的NMN 對模型小鼠的生存曲線的影響，發現與對照組相比，NMN 并不會顯著改變模型小鼠的生存時間。而后我們發現不同給藥方式也不能顯著改變小鼠潰瘍性結腸炎的狀態。最后我們又檢測不同濃度的NMN 對于腸炎小鼠的影響，發現300 mg/kg 劑量以下的NMN，對于模型小鼠的體重、DAI 評分、結腸組織均不能引起顯著性改變。因此，NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠并無影響。

圖4 不同濃度的NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠的作用

綜上，NMN 具有廣泛的人體生物調節作用，目前市面上出現了很多含有NMN 的保健品。雖然我們的研究結果表明NMN 對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎模型小鼠無明顯毒副作用，但是對于NMN 的副作用仍需繼續考察，特別是對于長期使用NMN 的人群來說，充分考察其安全性尤為重要。