信號轉導及轉錄激活因子3 抑制劑研究進展

劉 航，趙慶杰，徐 偉 （. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 35000；. 海軍軍醫大學藥學院，上海 00433）

信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一種信號轉錄蛋白[1]。該蛋白在結構上主要有N 末端、卷曲螺旋、DNA 接合、連結、SH2 和轉錄激活區域6 個位置域[2]。現有的研究結果表明，STAT3 抑制劑可靶向作用于STAT3 蛋白的不同結構區域，抑制其在細胞中的表達，為抗炎、抗癌治療提供思路[3-4]。

1 STAT3 作用機制

近年來研究者對STAT3 蛋白的探索不斷加深，對其在體內的活化機制也有清晰的發現[5]。STAT3 在細胞質中分析信號、轉導，在細胞核中轉錄激活[6]。STAT3 蛋白在細胞中扮演著重要角色，可影響細胞的生長凋亡機制，研究者們觀察到失控的STAT3 在異常激活中會導致細胞發生惡性轉化，對腫瘤細胞的形成和發展具有重要影響[7]。

STAT3 的激活可通過各種細胞因子、生長因子和激素與細胞表面的受體結合而實現。在Janus 激酶（JAK）-STAT3 信號途徑中，細胞因子與細胞膜上的蛋白受體結合，成為二聚體。二聚體在細胞質中募集并激活JAK 激酶蛋白，激活的JAK蛋白磷酸化受體酪氨酸殘基。隨后，STAT3 的Tyr705 殘基被JAKs 磷酸化，STAT3 蛋白被活化再形成二聚體后，從細胞質轉移到細胞核中，與特異性DNA 反應元件結合，最終調節STAT3 靶基因的表達[8]。

STAT3 的每個結構域各有其獨特的生物作用。STAT3 的N 末端結構域對STAT3 二聚體核易位以及DNA 結合具有重要作用；卷曲螺旋結構域對STAT3 與各種蛋白質的協同效應具有一定影響。DNA 結構域可匹配特殊的DNA 序列，然后形成STAT3-DNA 復合物。連接區域參加與細胞轉錄系統的相互作用。SH2 結構域對于STAT3 二聚化也至關重要。因為在腫瘤細胞中的過度激活現象，以及抗STAT3 的抑制劑對于抗炎免疫具有良好效果，STAT3 已成為近年來藥物研發的一個熱門方向，研究人員紛紛投入巨大熱情，不斷挖掘STAT3 的醫藥價值[9-10]。

2 STAT3 抑制劑分類

STAT3 抑制劑可靶向作用于STAT3 蛋白，抑制其在癌細胞中的磷酸化、二聚化以及核易位，使其轉錄功能喪失，有可能為疾病治療提供新方向[11]。

2.1 靶向N 端區域

Turkson 等[12]研究了STAT3 的結合肽PY*LKTK（Y*代表磷酸酪氨酸）在體外破壞STAT3 活性的能力。核提取物中PY*LKTK 的存在會導致STAT3 的DNA 結合活性水平顯著降低，因此破壞了核易位。作為肽直接抑制STAT3 的功能重要性的證據，發現PY*LKTK-mts（mts，膜移位序列）可在體內選擇性抑制組成型和配體誘導的STAT3 激活。此外，PY*LKTK-mts 可抑制Src 癌蛋白的轉化。Turkson 通過確定了抑制STAT3 信號轉導的最小肽，為使用該肽作為新型擬肽藥物進行臨床治療STAT3 異常激活的疾病提供了概念基礎。

Timofeeva 等[13]在表征STAT3-N 末端域的選擇性抑制劑ST3-H2A2 的作用中，觀察到該化合物使凋亡基因強烈激活，在癌細胞中誘導細胞凋亡。通過DNA-chip 技術和平鋪人類啟動子陣列技術，發現響應ST3-H2A2 的基因在表達激活的同時會伴隨著STAT3 染色質結合而改變。此外，將siRNA 敲低可證實ST3-HA2A 對基因表達和染色質結合的影響是STAT3 依賴性的，而C/EBP 同源蛋白（CHOP）啟動子的STAT3 結合區位于癌細胞中染色質的DNase I 超敏位點中，而不是未轉化細胞中，這表明STAT3 結合和抑制作用極有可能與染色質結構有關。因此我們猜想，STAT3-N 末端選擇性抑制劑可調節癌細胞凋亡基因的表達，促使細胞凋亡，為癌癥治療提供新方案。

2.2 靶向卷曲-螺旋區域

Huang 等[14]使用計算機虛擬篩選（AlloFinder）的途徑對STAT3 的C 端卷曲螺旋區域（CCD）進行匹配，通過對分數排名前15 的化合物進行生物測定，篩得理論最佳化合物K116（圖1）。在此化合物的作用下，熒光偏振顯示STAT3 的IC50值為7.99 μmol/L。在免疫印跡實驗中，STAT3 的Y705磷酸化被抑制，而上游的激酶Src 及其磷酸化無影響。同時，在腫瘤細胞株MDAMB-468 及DU145中，K116 表 現 出 對STAT3 很 強 的 抑 制，IC50為4.46 和23.85 μmol/L，表明K116 具有良好的特異性抑制STAT3 的作用。從K116 的研究歷程來看，未來進行虛擬篩選的計算化學方法將逐步成為藥物研發的一種趨勢，在此趨勢發展的初期，我們還需要不斷改進底層算法并完善數據庫內容。

2.3 靶向DNA 結合域

圖1 化合物K116 的化學結構

Huang 等[15]通過使用改進的虛擬篩選策略靶向STAT3 的DNA 結合域（DBD），得到了靶向STAT3-DBD 的小分子化合物inS3-54（圖2）。采用[32P]標記的DNA 雙鏈探針及電泳遷移率變動分析表明，inS3-54 選擇性抑制STAT3 與DNA 的結合，而對STAT1 無影響。與非癌細胞相比，inS3-54 優先抑制癌癥細胞的增殖，抑制STAT3 下游靶基因的表達和STAT3 原位結合染色質。因為inS3-54 不與SH2 結構域相連接，不抑制STAT3 二聚化，但可以抑制STAT3 與基因組DNA 的結合。inS3-54 代表了一種新型探針，對于開發靶向STAT3的DBD 域特異性抑制劑具有積極意義。

圖2 化合物inS3-54 的化學結構

Buettner 等[16]為了證明化合物C48（圖3）可作為STAT3 的選擇性抑制劑，使用定點誘變和多種生化技術，探明C48 將STAT3 中的Cys468 烷基化的過程。進一步研究證明，C48 會在STAT3 過度表達的腫瘤細胞系中阻止STAT3 核易位，導致小鼠體內腫瘤生長的顯著抑制。這些發現表明，STAT3 中的Cys468 代表了一個新的治療干預位點，并推測烷基化有望成為STAT3 相關類型癌癥的潛在治療方法。

圖3 化合物C48 的化學結構

2.4 靶向SH2 結構域

Cheng 等[17]研究化合物6-OAP(圖4)與肺癌細胞的作用關系，發現該化合物在H1975 和A549 細胞中以劑量和時間依賴性的方式抑制了STAT3 的轉錄(抑制位點Tyr705)，進而抑制由IL-6 等細胞因子誘導的STAT3 的活化、磷酸化與二聚體的形成。6-OAP 在STAT3 的SH2 結構域與Ser611/Ser613/Arg609 形成氫鍵，阻礙IL-6 誘導的STAT3 磷酸化，對肺癌細胞和對S 期激酶相關蛋白轉錄有抑制作用。藥理實驗表明，6-OAP 抑制靜脈注射肺癌細胞的SCID 小鼠的腫瘤生長。6-OAP 的效果優異，毒副作用較小，有望進一步挖掘其藥用價值。

圖4 化合物6-OAP 的化學結構

Schust 等[18]從化學數據庫中通過模擬篩選得到化合物Stattic（圖5）。Stattic 能有效抑制STAT3的SH2 結構域，對STAT3 的激活、二聚化和核易位等關鍵步驟有阻滯作用。將MDA-MB-231 和MDA-MB-435S 細胞在指定濃度下用Stattic 處理2 h，對STAT3、p-STAT3 和其他信號分子(JAK1/JAK2 等)的全細胞裂解物進行蛋白質印跡分析，證明了Stattic 對STAT3 的磷酸化有顯著的抑制效應，且其特異選擇性較高，有潛力成為高效的STAT3 抑制劑。

圖5 化合物Stattic 的化學結構

Chen 等[19]通過傳統的有機合成方法得到了化合物HJC0152（圖6），發現其對人乳腺癌和胰腺癌細胞顯示出比氯硝柳胺相似或更高的效力。經過結構修飾后（將苯環上的烷氧基改為氨基）的HJC0152 顯示出優異的水溶性，與氯硝柳胺相比提高了約3 300 倍。在光學顯微鏡的觀察下，將MDAMB-231 乳腺癌細胞用化合物HJC0152 處理48 h，觀察細胞形態變化，發現細胞周期進程被抑制，細胞凋亡變得更加常見。在帶有乳腺腫瘤異種移植物的裸鼠中，HJC0152 顯著抑制了腫瘤的生長。從這些結果中推測，具有更好水溶性的化合物HJC0152 有望被開發成用于癌癥治療的口服生物利用劑。

圖6 化合物HJC0152 的化學結構

Shin 等[20]首次報道了隱丹參酮（圖7）抗癌活性是通過抑制STAT3 實現的。隱丹參酮可快速抑制DU145 人前列腺癌細胞中的STAT3 的Tyr705磷酸化，降低STAT3 下游靶蛋白的表達。隱丹參酮抑制STAT3 磷酸化是由獨立于JAK2 的機制引起的，且不影響上游酪氨酸激酶。隱丹參酮可直接與STAT3 分子結合（STAT3 的SH2 結構域），抑制其二聚化，并下調細胞周期蛋白D1、Bcl-xL 和survivin 的表達，使G0-G1 期的細胞蓄積，降低STAT3 轉錄調控活性。這些結果表明，隱丹參酮是良好的STAT3 靶向抑制劑。

圖7 隱丹參酮的化學結構

Iwamoto 等[21]研究發現，苯達莫司汀（BENDA，圖8）作為一種烷化劑，對多種癌癥具有臨床活性，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病和多發性骨髓瘤等。BENDA 可以選擇性結合細胞中的STAT3 并抑制其活性，BENDA 在體外選擇性地拮抗STAT3-SH2 結構域（IC50=7.4 μmol/L），而不是其他含有SH2 的蛋白質（拮抗STAT1-SH2 的IC50為60 μmol/L）。BENDA 結合到STAT3 中的半胱氨酸殘基Cys550 和Cys712 位置上，從而抑制SH2 與相應的p-Tyr 肽的結合。

圖8 苯達莫司汀的化學結構

Chang 等[22]研究發現，STAT3 抑制劑BBI608（圖9）是降低EGFR 陽性肺癌細胞系細胞活力的潛在藥物。BBI608 可降低組蛋白甲基轉移酶G9a 介導的表皮生長因子受體3 表達，抑制EGFR陽性肺癌（包括EGFR E746-A750 HCC827、WTA549 和T790 M H1975）的細胞活力。在與阿法替尼的對照實驗中，BBI608 更為明顯地降低了A549和H1975 細胞的生存能力，并降低了A549 的細胞遷移。因此，BBI608 極有潛力成為EGFR 陽性肺癌的治療藥物。

研究表明，STAT3 在各種類型的癌癥中被組成性激活，并且直接參與癌細胞的免疫調節。Shastri 等[23]對骨髓增生異常綜合征（MDS）和急性髓性白血病（AML）患者的造血干細胞和祖細胞群體進行轉錄組分析，發現STAT3 存在異常激活現象，而敲除STAT3 后，體內白血病細胞的生長也受到了抑制，各類癌基因在惡性細胞中的表達也隨之下降。

3 結語

STAT3 在多種實體瘤和血液性腫瘤中會過度激活，對腫瘤的發生和發展有著重要影響。因此，STAT3 作為治療腫瘤的新靶點已被研究人員所認同；同時，STAT3 抑制劑對抗炎免疫有重要作用，在類風濕性關節炎等疾病研究中頗有成效。21 世紀以來，STAT3 抑制劑的臨床前研究不斷深入，但進入臨床使用的藥物卻很少。因此，研發高效、低毒的STAT3 抑制劑仍將是一種挑戰。近年來，研究人員將多種天然產物（如雷公藤紅素等）作為先導化合物，合成了更有效的小分子化合物，通過不斷篩選、評價和選擇活性大、特異性強的STAT3抑制劑，將中西醫藥物治療與放療、化療結合，這可能是今后的STAT3 研究方向之一，為抗腫瘤以及抗炎免疫研究提供新方向。