褐化抑制對‘鳳丹’試管苗擴繁培養中酚類物質含量及相關酶活性的影響

王若馨，王華芳

(1. 北京林業大學 林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2. 北京林業大學 生物科學與技術學院，北京 100083)

‘鳳丹’(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang var.‘lishizhenii’ B. A. Shen)屬芍藥科芍藥屬牡丹組(Paeoniasect. Moutan)楊山牡丹變種[1]，抗逆性強，適應性廣，全國廣為栽培，為中藥牡丹皮(丹皮)主要品種，亦作觀賞品種繁殖砧木。花單瓣，結實量大，籽油產量高，集觀賞、藥用與油用價值于一體。21世紀初將‘鳳丹’拓展為新興木本油料作物，其籽油不飽和脂肪酸含量92%以上，其中α-亞麻酸含量達44%，具有調節血壓、血糖、血脂，增強免疫力，抗氧化等功效[2-4]。對‘鳳丹’藥食同源優良品種的繁育研究具有重要科學和生產實際意義。

‘鳳丹’傳統繁殖方式包括播種、嫁接、分株等，實生苗個體差異大，播種難以保持母株優良性狀，嫁接和分株受材料、季節等諸多限制，繁殖系數低，難以實現工廠化標準化生產[5]。植物組織培養能實現快速繁育并保持母株優良性狀。牡丹組織培養于1965年首次報道用胚為外植體誘導愈傷組織[6]，此后以花藥[7]、腋芽[8]、莖尖[9]、葉片和葉柄[10]、子葉[11]等為外植體建立組織培養體系。‘鳳丹’較一些草本植物含有較多酚類化合物，酚類物質分布在液泡中，當組織剪切或受傷時，酚類與質體或細胞膜上的多酚氧化酶(PPO)的區域化被打破，酶促反應使酚類被氧化，產生褐色有害的醌類物質，導致組織死亡[12]。據報道，‘鳳丹’鱗芽在培養基上的第10天褐化率可達64.3%[13]。褐化成為‘鳳丹’快速繁殖的主要瓶頸，嚴重影響產業化應用。近年來，用抗氧化劑抑制‘鳳丹’培養物褐化也有報道，‘鳳丹’擴繁培養基中添加維生素C(Vc)15 mg/L、核黃素(VB2)20 mg/L時，褐化級別由3級降為1級[5]。低溫結合3 mg/L硝酸銀(AgNO3)處理可使‘鳳丹’鱗芽褐化率降至29.15%[14]。

褐化抑制機理的研究可為降低‘鳳丹’試管苗褐化率及提高繁殖效率提供理論依據和技術支撐，而這方面的研究鮮有報道。總酚含量、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)等與酶促褐化密切相關[12]。本研究以‘鳳丹’不定芽為材料，選擇不同濃度的維生素C、硝酸銀以及不同時間的 4 ℃低溫、暗處理，研究多種處理的抗褐化與擴繁效果；測定總酚含量、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性，探討‘鳳丹’褐化發生的生理生化機理，為促進其組織培養產業化發展提供技術及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料‘鳳丹’(PaeoniaostiiT.Hong et J. X. Zhang var. ‘lishizhenii’ B. A. Shen)為筆者實驗室繼代保存，取自北京順義基地(40.2°N，116.5°E)，年平均降水量610 mm，年平均氣溫11.5 ℃，最高溫度42.0 ℃，最低溫度-19.1 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 不同抗褐化處理對‘鳳丹’試管苗褐化及生長的影響 選擇生長健壯、表型一致的不定芽接種到改良WPM培養基[15]+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA30.05 mg/L, 培養基分別添加抗褐化劑維生素C(50、75、100和125 mg/L)、AgNO3(20、40、60、80 mg/L)、黑暗預處理(1、3、5、7 d)、4 ℃低溫預處理(1、3、5 d)，以不處理為對照進行培養，培養條件為(24±1) ℃，日光燈光密度為36 μmol/(m2·s)，光照16 h /黑暗8 h。每個處理6瓶，每瓶5個芽，重復3次。在轉接后10、20、30 d取材分別統計相關數據。

轉接后30 d統計褐化率(%)、褐化半徑(褐色物質的溢出半徑)、生長量(g)、增殖系數和死亡率(%)。增值芽的標準是有獨立莖段且莖段長≥0.5 cm，莖基部直徑≥0.4 cm，且能夠單獨切割下來進行培養的芽。褐化率=褐化數/接種數×100%；增殖系數=30 d的不定芽總數/接種的芽總數；在超凈工作臺上，將試管苗置于分析天平上稱量，計算試管苗的生長量，生長量=W1-W0(W1為30 d后的質量，W0為轉接時質量)；死亡率=死亡不定芽數/不定芽總數×100%。

1.2.2 生化指標測定 總酚含量測定參照毛沛琪等[16]方法略作修改。酶液制備參照毛沛琪等[16]方法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑NBT光化還原法[17]；過氧化物酶(POD)酶活性測定采用愈創木酚法[17]；多酚氧化酶(PPO)酶活性的測定采用鄰苯二酚比色法[18]。每個處理3個生物學重復，3個技術重復。

1.3 數據處理

以Excel 2016計算數據標準誤，IBM Statistical Package for Social Sciences 23.0軟件對實驗數據進行方差分析并進行Duncan’s多重檢驗及皮爾遜相關性分析。

2 結果與分析

2.1 抗褐化處理對‘鳳丹’試管苗褐化率及褐化半徑的影響

不同抗褐化處理對‘鳳丹’試管苗的褐化率、褐化半徑的影響如表1所示。AgNO3不同濃度處理的褐化率差異較大，褐化率隨處理濃度的增大呈先降低后升高的趨勢。其中， AgNO360 mg/L的處理褐化率最低，為23.33%，試管苗褐化程度淺，與對照組差異顯著(P<0.05)，其他濃度處理的褐化率與對照組差異不顯著。AgNO3處理的褐化半徑與對照組差異不顯著。隨著Vc濃度的升高，褐化率呈現先降低后升高的趨勢。培養基中分別添加Vc 75 mg/L和100 mg/L的試管苗褐化率顯著低于對照組，分別為29.44%和31.59%，褐化程度較淺，滲出的褐色物質較少，Vc 75 mg/L與100 mg/L處理之間無顯著差異，褐化半徑與對照組差異也不顯著。暗處理3 d與4 ℃低溫3 ～5 d均能顯著降低褐化率，褐化物質滲出物減少，褐化半徑與對照差異不顯著。以上表明在不同抗褐化處理控制‘鳳丹’試管苗褐化方面，AgNO360 mg/L處理效果最好，褐化率降至23.33%。

2.2 抗褐化處理對‘鳳丹’試管苗增殖系數、生長量及死亡率的影響

抗褐化處理對‘鳳丹’試管苗的增殖系數、生長量及死亡率有影響(表1)。對照組試管苗的增殖系數為1.76，生長量為0.23 g，死亡率為 2.22%。培養基中添加Vc 50～125 mg/L，增殖系數與對照無顯著差異(P>0.05)。添加Vc 100～125 mg/L則試管苗生長量顯著降低，最低為0.16 g，且死亡率顯著升高，同時植株出現玻璃化。添加AgNO360 mg/L能顯著提高試管苗增殖系數至2.28，生長量達0.33 g；添加AgNO340～60 mg/L均能顯著提高試管苗生長量，同時植株生長迅速，且無植株死亡。 暗處理1～7 d均能促進試管苗生長，植株生長較好，無死亡情況。其中，暗處理3 d的效果最好，增殖系數和生長量均顯著高于對照組，無死亡現象。4 ℃低溫處理的試管苗增殖系數隨著處理天數的增加逐漸減小，死亡率逐漸上升，處理5 d死亡率達12.78%。以上不同處理效果最好的是暗處理3 d，增殖系數為2.30，生長量可達0.39 g。

表1 第30天時不同抗褐化處理的‘鳳丹’試管苗褐化及生長情況Table 1 Browning and growth of P.ostii var. ‘lishizhenii’ tube seedlings under different anti-browning treatments on 30th day

2.3 抗褐化處理對‘鳳丹’試管苗生理生化的 影響

2.3.1 總酚含量 以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制的標準曲線方程為y= 0.115 4x，相關系數R2=0.990 4，表明標準品梯度濃度線性關系良好，x的單位是μg/mL。不同抗褐化處理總酚含量變化如圖2-A所示。在處理10 d時，對照及不同抗褐化處理的總酚含量與0 d時相比均有顯著上升，分別增加54.64%、 43.83%、29.13%、46.32%、36.80%。隨后，總酚含量呈現先升高后降低的趨勢。各處理在30 d的總酚含量分別低于對照組13.68%、20.82%、 9.94%、18.09%，表明各處理均能降低酚類物質的含量。處理培養30 d時，除暗處理3 d組外的其他處理總酚含量均顯著低于對照組(P< 0.05)，其中添加AgNO360 mg/L處理的總酚含量最低，僅為287.27 mg/kg。

2.3.2 多酚氧化酶活性 不同抗褐化處理的PPO活性隨培養時間延長呈先升高后降低的趨勢(圖2-B)。對照及不同抗褐化處理的總酚含量與0 d時相比均有顯著上升，增幅依次為對照 15.57%、暗處理3 d 12.69%、Vc 75 mg/L 8.87%、4 ℃低溫3 d 5.07%、AgNO360 mg/L 3.61%，可以得出各抗褐化處理組均能一定程度降低PPO活性。培養10～30 d，各處理的PPO活性逐漸降低。各處理在30 d的總酚含量分別低于對照組6.52%、9.68%、4.93%、6.94%， 但差異不顯著(P>0.05)。其中，添加AgNO360 mg/L處理的PPO最低，僅為74.35 U/(g·min)。

2.3.3 超氧化物歧化酶活性 抗褐化處理的SOD活性隨培養時間的延長呈先升高后降低的趨勢(圖2-C)。培養10 d時，除對照組和 4 ℃低溫3 d外其余組與0 d相比均顯著上升，分別為31.15%、38.08%、28.28%。除4 ℃低溫3 d外，各處理30 d的SOD活性均高于對照組，各抗褐化處理的SOD活性依次為AgNO360 mg/L>Vc 75 mg/L>暗處理3 d>對照>4 ℃低溫3 d，但差異不顯著(P>0.05)。其中添加AgNO360 mg/L的SOD活性最高，高于對照15.77%。

2.3.4 過氧化物酶酶活性 不同抗褐化處理的POD活性(圖2-D)隨培養時間的延長呈先升高后降低的趨勢。各處理10～30 d，POD活性均高于對照組，且與0 d的POD活性差異顯著(P<0.05)；處理10 d時，分別上升46.26%、87.04%、113.94%、81.52%，60.97%，表明各抗褐化處理均能提高POD活性。培養30 d時，AgNO360 mg/L和 3 d 4 ℃低溫處理的POD活性顯著高于對照組，其中添加AgNO360 mg/L，酶活最高可達53.32 U/(g·min)。

2.3.5 總酚含量、POD、PPO及SOD活性與褐化率的相關性分析 總酚含量、SOD、PPO及POD活性與褐化率的相關關系如表2，總酚含量與褐化率呈極顯著正相關性，相關系數為0.758；過氧化物酶(POD)活性與褐化率呈顯著負相關，相關系數為-0.610；多酚氧化酶(PPO)活性與褐化率呈顯著正相關，相關系數為0.527；超氧化物歧化酶(SOD)活性與褐化率無明顯相關性；總酚含量與POD呈極顯著負相關，相關系數為-0.740。

表2 總酚含量、POD、PPO及SOD活性與褐化率的相關性分析Table 2 Correlations between browning degree,total phenolic content and activities of POD, PPO and SOD

3 討 論

抗氧化劑和吸附劑等常用于牡丹組織培養的褐化抑制，‘烏龍捧盛’(Paeoniasuffruticosacv. ‘Wulongpengsheng’)培養基中加入2 mg/L的AgNO3能有效控制褐化，并促進組培苗生長與增殖[19]。‘洛陽紅’(Paeoniasuffruticosacv. ‘Luoyang Red’)培養基中附加0.5 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可減輕試管苗褐化[20]。本研究發現，適當濃度的Vc、AgNO3及黑暗、4 ℃低溫處理能夠有效防止‘鳳丹’試管苗褐化，促進生長。添加60 mg/L AgNO3抑制褐化效果最佳(表1)，褐化率降至23.33%，植物受傷產生大量乙烯致使試管苗褐化，銀離子可破壞乙烯受體，抑制培養物褐化的發生。但是隨著銀離子濃度的升高，褐化也加重，這可能是高濃度的銀離子使培養物中毒所致[21-22]。暗處理3 d促進生長(表1)，增殖系數增至2.30，生長量較對照組增長0.15 g。該結果與程強強等[23]對蝴蝶蘭(Phalaenopsis)不定芽擴繁的研究結果一致。暗處理使細胞內GA含量升高，GA可促進細胞延長[24]。因此，較短時間的暗培養有助于‘鳳丹’芽的增殖和生長。

‘鳳丹’試管苗褐化率與總酚含量呈極顯著正相關。因此降低總酚含量可以有效地減輕褐化。由于不同物種或同一物種的不同部位酚類物質種類和含量不同[13,25]，幼嫩的、活力旺盛的組織中酚類化合物積累較少，其褐化也較輕微。在實際操作中，選擇幼嫩的、生命活力旺盛的材料，如胚、分生組織等，便于建立抗褐化培養體系。‘鳳丹’中酚類物質種類及含量對組織褐化抑制也至關重要，相關研究有待進行。總酚含量與POD活性呈極顯著負相關，Francisco等[26]發現POD利用培養物受傷后釋放的H2O2來催化酚類物質氧化。因而可通過提高POD活性使更多酚類物質發生轉化，具體結果還有待進一步研究。

褐化率與總酚含量和PPO、POD及SOD酶活變化的關系在多個物種中都有報道。許傳俊等[27]發現蝴蝶蘭(Phalaenopsis)外植體褐變與PPO、POD的活性呈正相關。Boonsiri等[28]對低溫貯藏的尖辣椒(CapsicumannuumL.)種子褐變研究發現褐變與POD呈負相關。本研究結果表明褐化率與PPO酶活呈顯著正相關，而與POD酶活呈顯著負相關，而SOD與褐化率并無顯著的相關性，這一結果與其他物種中褐化與酶活關系的研究結果有相似但也有所不同[27-30]。PPO在植物體中催化酚類物質形成醌類物質，醌類物質經非酶促聚合生成有害褐色物質，致使培養物死亡[31]。POD可催化清除組織中的H2O2和超氧陰離子，保護細胞膜透性，抑制褐變發生[32]。這表明PPO和POD與降低‘鳳丹’試管苗褐化關系密切。反義PPO基因可抑制多酚氧化酶活性，降低酚類物質含量以減輕馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)塊莖損傷褐化[33]。在后續研究中，可通過尋找并調節與酚類含量相關的酶及其基因的表達，從而達到抑制‘鳳丹’植物組織培養褐化的目的，有關研究將根據需要不斷深入，為其優質苗木規模化生產提供理論和技術支撐。

4 結 論

本研究以‘鳳丹’試管苗為研究對象，發現培養基中添加硝酸銀60 mg/L褐化抑制效果最好，3 d暗處理增殖效果最好；試管苗總酚含量、多酚氧化酶(PPO)與褐化率呈現極顯著正相關(P<0.01)，過氧化物酶(POD)顯著負相關(P< 0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)無顯著相關性，總酚含量與POD呈極顯著負相關(P<0.01)，表明PPO和POD與 ‘鳳丹’試管苗褐化關系密切，其調控及基因的表達有極大的研究價值。